對(duì)蝦腸道益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫力和抗病力影響的研究.pdf

1、高密度集約化的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)在世界范圍內(nèi)興起,由對(duì)蝦自身和外界環(huán)境引起的各種細(xì)菌性、病毒性疾病嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展,同時(shí)也帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在此背景下各種措施應(yīng)運(yùn)而生,但抗生素,消毒劑和殺蟲劑等治病的傳統(tǒng)方法得到了質(zhì)疑,可替代方法在不斷探索之中,提高機(jī)體自身免疫力和抗病力是解決這一難題的重要思路之一。近年來益生菌作為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的可替代途徑引起熱議,相關(guān)報(bào)道從益生菌應(yīng)用的良好效果,無污染和安全性等方面均做了細(xì)致研究。本論文

2、將分離自健康對(duì)蝦腸道的幾株益生菌進(jìn)行不同的配伍添加在對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料中,以觀察其對(duì)對(duì)蝦非特異性免疫力和抗病毒能力的影響,同時(shí)進(jìn)行了部分分子生物學(xué)分析以期為益生菌的作用機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分以下幾方面:
　　 1.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對(duì)凡納濱對(duì)蝦部分非特異性免疫

3、酶活性和抗病力的影響:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌(不少于1.0×108CFU／g飼料)分別與美人魚發(fā)光桿菌(1％)和溶藻弧菌(1％)滅活菌配伍后加入基礎(chǔ)飼料作為免疫飼料。以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程采取間隔投喂(之前被驗(yàn)證為效果較好的投喂方式)。免疫15d后進(jìn)行WSSV病料(感染量0.9g／10尾)人工投喂感染,感染時(shí)間為15d。實(shí)驗(yàn)期間每5d采集各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦血淋巴,處理后用于超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP

4、)、一氧化氮合酶(NOS)和溶菌酶(UL)活力的測(cè)定。感染后每天記錄對(duì)蝦死亡數(shù),并統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率。結(jié)果表明,各免疫組超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合酶(NOS)活性整體上均顯著高于對(duì)照組,但飼料中添加益生菌對(duì)溶菌酶活性物顯著影響。累計(jì)死亡率結(jié)果表明:添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌混合組的抗病毒能力最強(qiáng)(10.71％),顯著高于對(duì)照組(64.28％),其次是堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和溶

5、藻弧菌混合組。研究結(jié)果證實(shí):在飼料中添加益生菌可顯著提高凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫酶活性和抗病毒能力,其中尤以堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌的復(fù)合菌組效果最佳。
　　 2.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道消化酶活性和腸道菌群的影響:按第一部分中進(jìn)行配伍后制備免疫飼料,實(shí)驗(yàn)分組和處

6、理同前。實(shí)驗(yàn)期間每5d無菌條件下取對(duì)蝦腸道勻漿,一部分用于消化酶(胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶)活性的測(cè)定,一部分進(jìn)行梯度稀釋后涂布2216E固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明,飼料中添加益生菌的免疫組對(duì)胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶均表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,在免疫階段和感染階段整體上都是先上升后下降,且這個(gè)實(shí)驗(yàn)階段的最大值一般出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)25d,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)又大體回落至實(shí)驗(yàn)初期水平。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各免疫組的消化酶活多數(shù)階段均顯著高于對(duì)照組(P<0.0

7、5)。這種規(guī)律變化說明飼料中添加的益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道具有調(diào)節(jié)作用,由免疫期間的先上升后下降可以看出益生菌的這種調(diào)節(jié)作用并不是無限增加的。在感染階段,出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),說明益生菌對(duì)病毒感染能做出相應(yīng)反應(yīng),但其反應(yīng)也不是持續(xù)不變的。在腸道菌群變化上,堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌混合菌組的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和優(yōu)勢(shì)菌總數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其余免疫組差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明,飼料中添加腸道益生菌可顯著改善對(duì)蝦

8、腸道消化酶活性并對(duì)腸道菌群有一定調(diào)節(jié)作用,這與益生菌在宿主體內(nèi)發(fā)揮作用的主要途徑是一致的。
　　 3.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對(duì)凡納濱對(duì)蝦部分免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響:實(shí)驗(yàn)以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組,以添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌(不少于1.0×108CFU／g飼料)和美人魚發(fā)光桿菌(1％)和溶藻

9、弧菌(％)的飼料為免疫組。每組3個(gè)重復(fù),實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行間隔投喂。每5d取各實(shí)驗(yàn)組10-15尾對(duì)蝦抽取血淋巴離心后收集血細(xì)胞用于RNA的提取,以β-actin為內(nèi)參基因,對(duì)凡納濱對(duì)蝦STAT基因,超氧化物歧化酶(SOD)基因和酚氧化酶原(proPO)基因用Rotor-gene3000進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,用2-ΔΔCT法進(jìn)行各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析。結(jié)果表明,在飼料中添加益生菌對(duì)酚氧化酶原(proPO)基因的相對(duì)表達(dá)有一定影響但并不

10、顯著高于對(duì)照組,對(duì)STAT和超氧化物歧化酶(SOD)基因的相對(duì)表達(dá)幾乎沒有影響。
　　 4.4株對(duì)蝦環(huán)境共生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦益生作用的研究:實(shí)驗(yàn)旨在探究分離自健康凡納濱對(duì)蝦消化道和養(yǎng)殖水體的幾株細(xì)菌:微小桿菌(Microbacterium spp)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的益生

11、作用。將上述菌株單一或者復(fù)合后加入基礎(chǔ)飼料配制免疫飼料,以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組,每組三個(gè)重復(fù),對(duì)個(gè)體質(zhì)量為(6.1±0.2)g的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行為期30d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。每5d取樣,以血清中的堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(UL)和酚氧化酶(PO)活性為免疫指標(biāo),探討了對(duì)蝦環(huán)境共生菌作為飼料添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫水平的影響；在投喂免疫飼料后的第16d,按1.00g／10尾的劑量,直接投喂感染

12、白斑綜合征病毒(WSSV)對(duì)蝦病料,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組累計(jì)死亡率,分析對(duì)蝦環(huán)境共生菌作為飼料添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病毒感染能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:添加細(xì)菌的免疫組對(duì)蝦血清中SOD、PO、AKP、UL和NOS活性均未明顯高于對(duì)照組,且有部分免疫組的免疫相關(guān)酶活低于對(duì)照組；各免疫組對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗WSSV感染的能力也無顯著提高。以上結(jié)果表明:本實(shí)驗(yàn)中在飼料中添加的4株細(xì)菌并未能提高凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫水平和抵抗疾病的能力,暫不將其作為對(duì)蝦免疫增強(qiáng)