對蝦腸道益生菌對凡納濱對蝦非特異免疫力和抗病力影響的研究.pdf

1、高密度集約化的對蝦養(yǎng)殖業(yè)在世界范圍內(nèi)興起,由對蝦自身和外界環(huán)境引起的各種細(xì)菌性、病毒性疾病嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展,同時(shí)也帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在此背景下各種措施應(yīng)運(yùn)而生,但抗生素,消毒劑和殺蟲劑等治病的傳統(tǒng)方法得到了質(zhì)疑,可替代方法在不斷探索之中,提高機(jī)體自身免疫力和抗病力是解決這一難題的重要思路之一。近年來益生菌作為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的可替代途徑引起熱議,相關(guān)報(bào)道從益生菌應(yīng)用的良好效果,無污染和安全性等方面均做了細(xì)致研究。本論文

2、將分離自健康對蝦腸道的幾株益生菌進(jìn)行不同的配伍添加在對蝦基礎(chǔ)飼料中,以觀察其對對蝦非特異性免疫力和抗病毒能力的影響,同時(shí)進(jìn)行了部分分子生物學(xué)分析以期為益生菌的作用機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分以下幾方面:
　　 1.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對凡納濱對蝦部分非特異性免疫

3、酶活性和抗病力的影響:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌(不少于1.0×108CFU／g飼料)分別與美人魚發(fā)光桿菌(1％)和溶藻弧菌(1％)滅活菌配伍后加入基礎(chǔ)飼料作為免疫飼料。以基礎(chǔ)飼料為對照組,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程采取間隔投喂(之前被驗(yàn)證為效果較好的投喂方式)。免疫15d后進(jìn)行WSSV病料(感染量0.9g／10尾)人工投喂感染,感染時(shí)間為15d。實(shí)驗(yàn)期間每5d采集各實(shí)驗(yàn)組對蝦血淋巴,處理后用于超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP

4、)、一氧化氮合酶(NOS)和溶菌酶(UL)活力的測定。感染后每天記錄對蝦死亡數(shù),并統(tǒng)計(jì)對照組和實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率。結(jié)果表明,各免疫組超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合酶(NOS)活性整體上均顯著高于對照組,但飼料中添加益生菌對溶菌酶活性物顯著影響。累計(jì)死亡率結(jié)果表明:添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌混合組的抗病毒能力最強(qiáng)(10.71％),顯著高于對照組(64.28％),其次是堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和溶

5、藻弧菌混合組。研究結(jié)果證實(shí):在飼料中添加益生菌可顯著提高凡納濱對蝦非特異性免疫酶活性和抗病毒能力,其中尤以堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌的復(fù)合菌組效果最佳。
　　 2.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對凡納濱對蝦腸道消化酶活性和腸道菌群的影響:按第一部分中進(jìn)行配伍后制備免疫飼料,實(shí)驗(yàn)分組和處

6、理同前。實(shí)驗(yàn)期間每5d無菌條件下取對蝦腸道勻漿,一部分用于消化酶(胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶)活性的測定,一部分進(jìn)行梯度稀釋后涂布2216E固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明,飼料中添加益生菌的免疫組對胃蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶均表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,在免疫階段和感染階段整體上都是先上升后下降,且這個(gè)實(shí)驗(yàn)階段的最大值一般出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)25d,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)又大體回落至實(shí)驗(yàn)初期水平。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各免疫組的消化酶活多數(shù)階段均顯著高于對照組(P<0.0

7、5)。這種規(guī)律變化說明飼料中添加的益生菌對凡納濱對蝦的腸道具有調(diào)節(jié)作用,由免疫期間的先上升后下降可以看出益生菌的這種調(diào)節(jié)作用并不是無限增加的。在感染階段,出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,說明益生菌對病毒感染能做出相應(yīng)反應(yīng),但其反應(yīng)也不是持續(xù)不變的。在腸道菌群變化上,堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌混合菌組的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和優(yōu)勢菌總數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),其余免疫組差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明,飼料中添加腸道益生菌可顯著改善對蝦

8、腸道消化酶活性并對腸道菌群有一定調(diào)節(jié)作用,這與益生菌在宿主體內(nèi)發(fā)揮作用的主要途徑是一致的。
　　 3.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus),美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)不同配伍對凡納濱對蝦部分免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響:實(shí)驗(yàn)以基礎(chǔ)飼料為對照組,以添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌(不少于1.0×108CFU／g飼料)和美人魚發(fā)光桿菌(1％)和溶藻

9、弧菌(％)的飼料為免疫組。每組3個(gè)重復(fù),實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行間隔投喂。每5d取各實(shí)驗(yàn)組10-15尾對蝦抽取血淋巴離心后收集血細(xì)胞用于RNA的提取,以β-actin為內(nèi)參基因,對凡納濱對蝦STAT基因,超氧化物歧化酶(SOD)基因和酚氧化酶原(proPO)基因用Rotor-gene3000進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,用2-ΔΔCT法進(jìn)行各基因mRNA相對表達(dá)量的分析。結(jié)果表明,在飼料中添加益生菌對酚氧化酶原(proPO)基因的相對表達(dá)有一定影響但并不

10、顯著高于對照組,對STAT和超氧化物歧化酶(SOD)基因的相對表達(dá)幾乎沒有影響。
　　 4.4株對蝦環(huán)境共生菌對凡納濱對蝦益生作用的研究:實(shí)驗(yàn)旨在探究分離自健康凡納濱對蝦消化道和養(yǎng)殖水體的幾株細(xì)菌:微小桿菌(Microbacterium spp)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)對凡納濱對蝦的益生

11、作用。將上述菌株單一或者復(fù)合后加入基礎(chǔ)飼料配制免疫飼料,以基礎(chǔ)飼料為對照組,每組三個(gè)重復(fù),對個(gè)體質(zhì)量為(6.1±0.2)g的凡納濱對蝦進(jìn)行為期30d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。每5d取樣,以血清中的堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(UL)和酚氧化酶(PO)活性為免疫指標(biāo),探討了對蝦環(huán)境共生菌作為飼料添加劑對凡納濱對蝦非特異性免疫水平的影響；在投喂免疫飼料后的第16d,按1.00g／10尾的劑量,直接投喂感染

12、白斑綜合征病毒(WSSV)對蝦病料,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組累計(jì)死亡率,分析對蝦環(huán)境共生菌作為飼料添加劑對凡納濱對蝦抗病毒感染能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:添加細(xì)菌的免疫組對蝦血清中SOD、PO、AKP、UL和NOS活性均未明顯高于對照組,且有部分免疫組的免疫相關(guān)酶活低于對照組；各免疫組對凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力也無顯著提高。以上結(jié)果表明:本實(shí)驗(yàn)中在飼料中添加的4株細(xì)菌并未能提高凡納濱對蝦非特異性免疫水平和抵抗疾病的能力,暫不將其作為對蝦免疫增強(qiáng)