銅綠假單胞菌生物膜與藻酸鹽相關(guān)基因研究.pdf

1、銅綠假單胞菌是造成我國醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染及重癥監(jiān)護病房感染最主要的非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，耐藥性強，臨床治療棘手。隨著各種侵入性醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用，由銅綠假單胞菌生物膜造成的醫(yī)用材料相關(guān)感染的難治性已被臨床廣泛關(guān)注，而由銅綠假單胞菌引起的慢性難治性下呼吸道感染也與生物膜形成密切相關(guān)。細菌生物膜是指附著在有生命或無生命物體表面的由細菌自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)包裹的細菌細胞結(jié)構(gòu)群體，它是細菌的一種具有自我保護性的生長模式。與浮游細菌相比，生物

2、膜細菌對抗菌藥物的抗性可提高10～1000倍，現(xiàn)有藥物難以清除生物膜。生物膜細菌高度耐藥的機制尚未闡明，目前認為是多個因素的綜合作用造成的，包括細菌胞外多聚基質(zhì)的屏障作用、生物膜細菌生理上的不均質(zhì)性及生物膜結(jié)構(gòu)上的不均質(zhì)性。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)主要包含胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA，其中胞外多糖的重要成分——藻酸鹽在其生物膜形成和結(jié)構(gòu)方面的作用還存在爭議。以往的研究認為藻酸鹽在銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)方面具有重要作用，但最近Wo

3、zniak等人提出藻酸鹽不是非黏液型銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分，對其生物膜形成和結(jié)構(gòu)不起作用；而Stapper等人則認為藻酸鹽對銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)有一定影響但非決定因素。由于各研究組所采用的實驗方法具有差異，結(jié)果難以對比，目前對這一問題尚無定論。亞胺培南/西司他丁(泰能)是臨床治療重癥感染經(jīng)驗用藥的首選抗生素之一，最近有報道指出亞胺培南/西司他丁可誘導(dǎo)非黏液型銅綠假單胞菌PAO1藻酸鹽合成增加，促進其生物膜形成和

4、加厚，對亞胺培南/西司他丁在銅綠假單胞菌重癥感染并有合并生物膜感染可能時的應(yīng)用提出了疑問。對抗生物膜感染的方法除了研發(fā)新的抗生素外，從生物膜形成的各個階段著眼來阻止生物膜形成是目前研究的熱點，最近的研究表明胞外多聚基質(zhì)中的DNA成分為細菌生物膜形成所必需。本課題關(guān)注的問題包括：1)藻酸鹽對黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響；2)亞胺培南/西司他丁(泰能)能否在銅綠假單胞菌重癥感染并有合并生物膜感染可能時使用；3)從抑制胞

5、外多聚基質(zhì)中的DNA成分著手尋找新的治療銅綠假單胞菌生物膜感染的途徑。本課題以黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準菌株P(guān)AO1為研究對象，對以上三方面的問題進行了研究。 目的:研究藻酸鹽對黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響；觀察亞胺培南/西司他丁(泰能)對銅綠假單胞菌生物膜形成及藻酸鹽合成相關(guān)基因algD表達的影響，為臨床用藥提供實驗依據(jù)；檢測DNaseI對銅綠假單胞菌

6、生物膜形成和成熟生物膜的影響，為臨床治療銅綠假單胞菌生物膜感染提供新思路。 方法:改良平板培養(yǎng)法建立黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準菌株P(guān)AO1的體外生物膜模型；半定量RT-PCR方法檢測浮游狀態(tài)和生物膜形成不同時間點PA17和PAO1的藻酸鹽合成相關(guān)基因algD、algU和algR的表達，進行統(tǒng)計學(xué)分析；PCR方法擴增PA17和PAO1的藻酸鹽合成調(diào)節(jié)基因mucA全序列并測序比較；克隆PAO1的野生型muc

7、A基因并轉(zhuǎn)入PA17中表達，觀察表達野生型mucA基因的PA17的algD表達和生物膜形成過程；液體稀釋法檢測PA17和PAO1對常用抗菌藥物的最低抑菌濃度；掃描電鏡觀察1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司他丁對PA17和PAO1生物膜形成的影響；半定量RT-PCR方法檢測干預(yù)過程中不同時間點PA17和PAO1的藻酸鹽相關(guān)基因algD的表達情況；掃描電鏡觀察不同濃度DNaseI對PA17和PAO1生物膜形成及成熟生物膜的影響。

8、 結(jié)果:PA17于第6天形成成熟生物膜，PAO1于第3天形成成熟生物膜，兩者結(jié)構(gòu)均為薄膜狀。浮游狀態(tài)時，PA17的algD、algU和algR表達均較PAO1高，t檢驗顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。生物膜形成過程中algD和algU均在成熟生物膜形成時表達最高，algR在生物膜形成的第24h表達最高。單因素方差分析結(jié)果顯示生物膜形成的不同時間點algD、algU和algR表達的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。兩獨立樣本秩和檢驗顯示生物膜形成過程中PAO

9、1和PA17間上述基因表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PA17的mucA基因第166-333位核苷酸缺失，第342位A→G；PAO1的mucA基因序列與Genebank中公布的序列完全相同。克隆PAO1的mucA基因并轉(zhuǎn)入PA17中表達，表達重組質(zhì)粒PA17浮游狀態(tài)的algD表達下降，其生物膜形成速度居PAO1和PA17之間，8h時即可出現(xiàn)不可逆性黏附，與PAO1相同，成熟生物膜形態(tài)為薄膜狀。對PA17用1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司

10、他丁干預(yù)時，第3dalgD表達較未干預(yù)組分別增加1.5和3.4倍，生物膜形態(tài)無明顯變化；第6dalgD表達分別增加0.38和0.78倍，PA17分散的黏附于蓋玻片，沒有形成生物膜。對PAO1用1倍和10倍最低抑菌濃度的亞胺培南/西司他丁干預(yù)時，第24halgD表達較未干預(yù)組分別增加2.5和3.5倍，生物膜形態(tài)無明顯變化；第3d分別增加0.7和2.1倍，1倍最低抑菌濃度亞胺培南/西司他丁作用組仍可看到少量微菌落存在，10倍最低抑菌濃度作用

11、組僅見散在的細菌；第6d分別增加1.5和2.1倍，兩個濃度組均只見數(shù)個細菌黏附于蓋玻片。25U/ml的DNaseI即可抑制黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜，100U/ml的DNaseI可完全阻止其生物膜形成并徹底分解成熟生物膜。 結(jié)論:藻酸鹽主要在生物膜形成過程中微菌落分化為成熟生物膜的階段發(fā)揮作用，但不是決定性因素；黏液型銅綠假單胞菌PA17和非黏液型銅綠假單胞菌標(biāo)準菌株P(guān)AO1的生物膜結(jié)構(gòu)均為薄膜狀可能

12、與PA17和PAO1生物膜形成過程中藻酸鹽合成相關(guān)基因表達水平接近相關(guān)；PA17含新型mucA基因突變，這種新突變類型的mucA基因與PAO1的野生型mucA基因?qū)︺~綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響一致；野生型mucA基因不僅參與藻酸鹽合成，還可增強生物膜形成初期細菌的不可逆黏附能力，而PA17的新型mucA基因突變可減弱該能力；亞胺培南/西司他丁雖可誘導(dǎo)algD表達上調(diào)從而使銅綠假單胞菌藻酸鹽合成增加，但若從生物膜形成早期開始使用，仍可抑制