根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組后代酶活力和形態(tài)特性變化規(guī)律研究【畢業(yè)論文+任務(wù)書+開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+外文翻譯】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組后代酶活力和形態(tài)特性變化規(guī)律研究</p><p><b>　　

2、摘 要</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)是對(duì)根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因改組的后代進(jìn)行進(jìn)一步的研究，經(jīng)人工培養(yǎng)多代后觀察菌株的形態(tài)特征、部分生理生化特性分析。實(shí)驗(yàn)對(duì)親本米曲霉、根霉、及其融合后的后代進(jìn)行了傳代培養(yǎng)。通過對(duì)親本以及一、三、五、七代在生長(zhǎng)時(shí)的形態(tài)特征進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明親本和其雜交后代在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)都比較旺盛，菌體形狀顏色都比較相似。測(cè)定蛋白酶、淀粉霉的活力，淀粉霉活力中親本根霉的平

3、均Hc值是1.527，親本米曲霉的平均Hc值是1.518，而后代霉活最高的融合一代3的平均Hc值是1.781，最低的融合七代1的平均Hc值是1.193。SDS電泳分析發(fā)現(xiàn)后代的條帶大多比親本少，說明后代與親本存在一定差異。</p><p>　　關(guān)鍵詞：米曲霉；根霉；原生質(zhì)體；酶活力；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳</p><p><b>　　ABSTRACT</b><

4、;/p><p>　　This experiment is Rhizopus oryzae protoplasts with the restructuring of the descendants of a gene for further study, after several generations of artificial culture strains were observed morphologica

5、l, physiological and biochemical characteristics analysis.Experiments on the parent Aspergillus,Rhizopus, and their descendants were fused subculture.By parents,and one, three, five, seven generations in the growth morph

6、ology when quantitative analysis shows that parents and their hybrid offspring a</p><p>　　Keywords: Oryzae; Rhizopus; Protoplasts; Activity; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis</p><p><b&g

7、t;　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言3</b></p><p>　　1.1 研究的現(xiàn)狀3</p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)研究的意義4</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、設(shè)備和方法4</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料4</p>

8、<p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑4</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備5</p><p>　　2.4 主要溶液試劑及配制5</p><p>　　2.5 其他實(shí)驗(yàn)材料6</p><p>　　2.6 實(shí)驗(yàn)方法6</p><p>　　2.6.1 菌種活化6</p><p&g

9、t;　　2.6.2 菌絲體培養(yǎng)7</p><p>　　2.6.3 菌種融合過程7</p><p>　　2.6.4 誘變?cè)|(zhì)體8</p><p>　　2.6.5 高產(chǎn)酶菌株的篩選8</p><p>　　2.6.6 傳代培養(yǎng)8</p><p>　　2.6.7 形態(tài)觀察8</p><p>

10、;　　2.6.8 酶活測(cè)定8</p><p>　　2.6.9 蛋白質(zhì)提取9</p><p>　　2.6.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及分析9</p><p>　　3 結(jié)果與分析10</p><p>　　3.1 高產(chǎn)酶菌株的篩選10</p><p>　　3.2 后代形態(tài)分析10</p>&l

11、t;p>　　3.2.1 平板培養(yǎng)基觀察結(jié)果10</p><p>　　3.2.2 顯微鏡觀察結(jié)果11</p><p>　　3.2.3 淀粉酶活觀察結(jié)果12</p><p>　　3.2.4 蛋白酶活觀察結(jié)果13</p><p>　　3.3 酶活測(cè)定結(jié)果與分析14</p><p>　　3.3.1不同菌種的蛋白

12、酶活力測(cè)定結(jié)果與分析14</p><p>　　3.3.2 不同菌種的淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果與分析17</p><p>　　3.4 SDS凝膠電泳20</p><p>　　3.4.1 電泳掃描圖20</p><p>　　3.4.2 蛋白定量分析21</p><p>　　3.4.3 定量檢驗(yàn)報(bào)告21</p&g

13、t;<p>　　3.5 蛋白質(zhì)帶分析27</p><p>　　3.6 泳道中帶分布報(bào)告28</p><p>　　3.7 列相似性分析34</p><p>　　3.7.1 相似性圖表34</p><p>　　3.7.2 親本及其后代的聚類分析35</p><p><b>　　4 小結(jié)3

14、6</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)37</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 研究的現(xiàn)狀</b></p><p>　　米曲霉菌是一類重要的工業(yè)真菌，因能分泌多種酶類廣泛用于食品發(fā)酵等行業(yè)，且應(yīng)用領(lǐng)域

15、仍在不斷擴(kuò)展。為了向米曲霉的安全應(yīng)用提供更全面的參考信息，并希望從中尋找有藥理活性的藥物前體，本研究對(duì)米曲霉進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和探索[1]。</p><p>　　米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，

16、而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1000多年。</p><p>　　米曲霉是理想的生產(chǎn)大腸桿菌不能表達(dá)的真核生物活性蛋白的載體，米曲霉基因組所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。米曲霉基因組的破譯，也為研究由曲霉屬真菌引起的曲霉病提供了線索[2]

17、。</p><p>　　米曲霉菌落生長(zhǎng)快，10天直徑達(dá)5～6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會(huì)引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變[3]。</p><p>　　除了細(xì)菌以外，根霉是迄今為止絲狀菌中產(chǎn)L乳酸的另一重要菌種。根霉菌是真核生物,其核

18、有核膜包圍,具各種細(xì)胞器.基因結(jié)構(gòu)中編碼區(qū)不連續(xù)有內(nèi)含子，根霉菌分布廣，約10種以上。通常對(duì)人無害，食用甜酒藥及糖化飼料就是選用此菌制備的。根霉菌為條件致病菌?？梢鹗称访棺?，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染。有匍枝根霉、小孢根霉、少根根霉和米根霉等，可引起毛霉菌病，蜂窩組織炎等。</p><p>　　根霉、米曲霉原生質(zhì)體雙親融合后代第1-7代各后代的菌落、菌體形態(tài)特征的觀察、分析，通過對(duì)各后代蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力

19、、SDS電泳等多種方法測(cè)定、分析，同親本相比較，得出融合后代的形態(tài)特征、生理生化特性和穩(wěn)定性等遺傳特性和變化規(guī)律。</p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)研究的意義</p><p>　　米曲霉（Aspergillus oryzae）是釀造業(yè)中的重要微生物，對(duì)醬油、豆瓣、米酒等的產(chǎn)率和風(fēng)味起著重要作用。然而生產(chǎn)實(shí)踐中，米曲霉的生產(chǎn)能力常常欠佳，生長(zhǎng)較快的菌種往往蛋白酶活力較低，而蛋白酶活力較高的往

20、往生長(zhǎng)速度較慢。對(duì)米曲霉的選育，尤其是針對(duì)蛋白酶活力選育優(yōu)良的菌種一直以來都是一個(gè)重要課題，傳統(tǒng)采用的誘變得育種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且隨機(jī)性太大，不易得到理想菌種。對(duì)兩種霉的原生質(zhì)體融合后代進(jìn)行進(jìn)一步的研究，經(jīng)人工培養(yǎng)多代后進(jìn)行雜交試驗(yàn)，觀察菌株的形態(tài)特征、部分生理生化形態(tài)分析以及的分析，為得到品種更優(yōu)秀的，有利遺傳更穩(wěn)定的，作用范圍更廣的后代作鋪墊。于是該課題采用的是原生質(zhì)體融合的方法得到優(yōu)良菌種。</p><p>

21、　　2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、設(shè)備和方法</p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　菌種：米曲霉、根霉、米根融合菌株一代、米根融合菌株三代、米根融合菌株五代、米根融合菌株七代。</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑</p><p>　　表1 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑</p><

22、p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備</p><p>　　表2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備</p><p>　　2.4 主要溶液試劑及配制</p><p>　　（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：取一定量的馬鈴薯，洗凈、去皮、切塊，在電子天平上稱取100g左右，與500mL的蒸餾水一起放入鍋中，煮沸20分鐘，用四層紗布過濾后取浸出液，加入葡萄糖10g，瓊脂10g，溶解后加蒸餾水至

23、500mL。</p><p>　?。?）液體菌絲培養(yǎng)基：液體馬鈴薯培養(yǎng)基（PSA），用于菌絲體搖瓶發(fā)酵。配制方法：取一定量的馬鈴薯，洗凈、去皮、切塊，在電子天平上稱取100g左右，與500mL的蒸餾水一起放入鍋中，煮沸20分鐘后，用四層紗布過濾。然后取浸出液，加入蔗糖10g，溶解后用蒸餾水定容至500mL。</p><p>　?。?）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨15g，瓊脂7.5

24、g,淀粉1g,加蒸餾水定容到500mL。</p><p>　?。?）酪蛋白水解培養(yǎng)基：Na2HPO4?7H20 1.07g，KH2PO4 0.36g，酪蛋白10g瓊脂粉15g，加蒸餾水定容到1000mL。</p><p>　?。?）30%丙烯酰胺貯存液：稱取丙烯酰胺29.0g，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1.0g，加蒸餾水至100mL，裝于棕色瓶于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?lt;/p>&

25、lt;p>　?。?）Tris提取液：稱取12.114克 Tris，加蒸餾水定溶到100mL，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4。</p><p>　?。?）10％十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液：稱取十二烷基硫酸鈉（SDS）10克，加蒸餾水溶解定容至100 mL。</p><p>　?。?）10％過硫酸銨溶液：稱取過硫酸銨0.1克，加0.1 mL蒸餾水溶解。此溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用。</p>

26、<p>　　（9）分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH為8.8。</p><p>　　（10）濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl，pH為6.8。</p><p>　　（11）SDS-電極緩沖液：0.025mol/L Tris，0.192mol/L甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3。</p><p>　?。?2）分離膠：蒸餾

27、水16 mL，30%丙烯酰胺13.2 mL，1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 10 mL，10％十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液0.4 mL，10％過硫酸銨溶液0.4 mL，TEMED 0.016 mL。迅速混勻倒入兩玻璃板之間（大約離梳子的齒長(zhǎng)再加5cm處）。再在膠液上小心注入一層水，讓其凝固20～30分鐘[4]。</p><p>　　（13）濃縮膠：蒸餾水6.8mL，30%丙烯酰胺1.66mL，1

28、mol/L Tris-HCl（pH6.8）1.26mL，10％十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液0.1mL，10％過硫酸銨溶液0.1mL，TEMED0.01mL。迅速混勻倒在制備好的分離膠上，并插入梳子，上層用噴霧器覆蓋一水層，聚合30min[5]。</p><p>　?。?4）樣品處理液：50mM Tris-HCl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油。</p>&l

29、t;p>　?。?5）染色液：0.1％考馬斯亮藍(lán)R250，40％甲醇，10％冰醋酸。</p><p>　?。?6）脫色液：10％甲醇，10％冰醋酸。</p><p>　?。?7）盧戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300mL，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。</p><p>　　2.5 其他實(shí)驗(yàn)材料</p

30、><p>　　量筒、玻璃棒、燒杯、移液管、移液槍、槍頭、離心管、蒸餾水、一次性手套、TEMED、Molecular Imager GS-800 Calibrated Densitometer、Quantity one電泳分析軟件等。</p><p><b>　　2.6 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.6.1 菌種活化</p>

31、<p>　　將預(yù)先保留下來的兩種菌種（親本米曲霉和親本根霉）在無菌室的超凈工作臺(tái)上分別接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，接種完成后倒置放于23℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天。</p><p>　　2.6.2 菌絲體培養(yǎng)</p><p>　　于無菌室的無菌環(huán)境下，將液體培養(yǎng)基分裝入滅過菌的培養(yǎng)瓶中并標(biāo)號(hào)。將活化好的菌株接種入已經(jīng)滅過菌的盛有約30mL液體菌絲培養(yǎng)基的搖瓶中（菌絲大小不限，只

32、要用接種針在培養(yǎng)基表面菌落處輕輕蘸取一下即可，每次接種后接種針均要在酒精燈火焰中滅菌并冷卻才可挑取下一個(gè)菌絲）。之后放入30℃，轉(zhuǎn)速為120rad/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)16-18h。</p><p>　　2.6.3 菌種融合過程</p><p>　　原生質(zhì)體制備：將培養(yǎng)好的菌絲體培養(yǎng)液用四層擦鏡紙過濾，根據(jù)離心管大小裝入一定量的菌絲體到已滅菌的離心管中，以1400轉(zhuǎn)每分鐘的低轉(zhuǎn)速離心10mi

33、n。之后去除上清液。然后將沉淀移入另一個(gè)已經(jīng)稱量過的滅過菌的離心管內(nèi)，封好進(jìn)行稱量（菌絲的移動(dòng)和菌絲的接種，還有上清液的去除等等材料有機(jī)會(huì)接觸外界環(huán)境的情況下，這些操作都要在無菌的條件進(jìn)行）。</p><p>　　酶解液的體積按照以下方法來?yè)Q算：菌絲重量的1.5倍就是酶解液的量，酶解液為混合酶液，蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶以一定的濃度混合，用滲透壓穩(wěn)定劑配制而成。酶液的配置要當(dāng)天配當(dāng)天用。一是為了防止酶的失活，二是

34、防止對(duì)量的估計(jì)不足而造成浪費(fèi)。酶液的配置要在無菌條件下配置防止有雜菌的進(jìn)入，最后影響試驗(yàn)的結(jié)果。加入混合酶液后將菌絲和酶液充分混勻，放入適當(dāng)?shù)臏囟取⑥D(zhuǎn)速為100rad/min的搖床中酶解一定的時(shí)間（每分鐘40~100轉(zhuǎn)的震蕩不僅可以加快原生質(zhì)體的釋放,使達(dá)到最大的原生質(zhì)體形成率的時(shí)間縮短,有利于提高再生率,而且可以抑制孢子的萌發(fā),有利于原生質(zhì)體的形成）。</p><p>　　酶解完成之后將混合液用四層擦鏡紙（已紫

35、外滅菌）過濾，接著將濾液裝入EP管（已滅菌）以6000轉(zhuǎn)每分鐘的轉(zhuǎn)速離心20min（由于原生質(zhì)體小而輕所以一定要高轉(zhuǎn)速才能讓原生質(zhì)體沉淀下來）。之后取少許上清液在顯微鏡下進(jìn)行觀察，如沒有原生質(zhì)體說明原生質(zhì)體已經(jīng)完全沉淀了。此時(shí)可以將上清液去除（即將酶液去除，酶液的去除要盡快，否則會(huì)使酶解過程過度，從而造成原生質(zhì)體的破裂，影響原生質(zhì)體的形成），然后用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體。以上步驟都要在無菌的條件下進(jìn)行，防止雜菌的進(jìn)入，造成污染影響試驗(yàn)

36、結(jié)果。</p><p>　　2.6.4 誘變?cè)|(zhì)體</p><p>　　紫外照射法誘變?cè)|(zhì)體獲得后代[6]：用15 W國(guó)產(chǎn)紫外線燈管,照射距離30cm，各取5mL原生質(zhì)體懸浮液懸浮，于無菌平皿中分別進(jìn)行1、3、5、7min的照射誘變處理，分析致死率，取未誘變和致死率在80%以上的誘變時(shí)間的原生質(zhì)體涂布到再生平板上，在26～28℃，避光培養(yǎng)2～3天。</p><p&g

37、t;　　2.6.5 高產(chǎn)酶菌株的篩選</p><p>　　分別將未誘變和誘變后的再生培養(yǎng)基平板長(zhǎng)出的菌落接種到液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基中， 30 攝氏度培養(yǎng) 36h 后，按 5 %接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 30 攝氏度130r/min搖床培養(yǎng) 3-4d，分別測(cè)定蛋白酶活力，淀粉酶活力，重復(fù) 3 次，選取酶活力有提高的菌株。</p><p>　　2.6.6 傳代培養(yǎng)</p>&l

38、t;p>　　將融合后的菌種接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，澆制3個(gè)，即第二代。30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一天后取一點(diǎn)接種第3代，并在另一點(diǎn)蓋一蓋玻片，再培養(yǎng)一天，用于觀察形態(tài)特征，最后一點(diǎn)接種到斜面培養(yǎng)基上保存菌種。按這個(gè)步驟接種到第七代。</p><p>　　2.6.7 形態(tài)觀察</p><p>　　培養(yǎng)好的子代進(jìn)行菌落形態(tài)特征的觀察，觀察平板培養(yǎng)基上菌落蔓延狀況、疏松程度，表面濕潤(rùn)或干燥，有

39、無光澤，隆起形狀,邊緣的整齊度、大小、顏色等。</p><p>　　顯微鏡觀察菌種的形狀及出芽方式，仔細(xì)觀察孢子囊、假根、菌絲等的生長(zhǎng)情況，并拍照。</p><p>　　2.6.8 酶活測(cè)定</p><p>　　蛋白酶活測(cè)定：在無菌室的超凈工作臺(tái)上用接種針挑取每個(gè)菌落接種到PDA培養(yǎng)基上分離純化，每個(gè)培養(yǎng)基放3-5個(gè)，23℃培養(yǎng)24h。將分離后的菌落，用直徑2mm的

40、吸管戳4個(gè)小區(qū)域。每個(gè)菌落用接種針挑3個(gè)接種到酪蛋白培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h，48h分別觀察透明圈大小，并計(jì)算蛋白酶活力。</p><p>　　淀粉酶活測(cè)定：在超凈工作臺(tái)上用接種針挑取每個(gè)菌落接種到PDA培養(yǎng)基上分離純化，每個(gè)培養(yǎng)基放3-5個(gè)，25℃培養(yǎng)24h。將分離后的菌落，用直徑2mm的吸管戳4個(gè)小區(qū)域。每個(gè)菌落用接種針挑3個(gè)接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h，48h后滴加盧戈氏碘液分別觀察透明圈

41、大小，并計(jì)算淀粉酶活力。</p><p>　　2.6.9 蛋白質(zhì)提取</p><p>　　將過濾得到的擴(kuò)大菌絲在45℃烘箱中烘數(shù)小時(shí)得到基本干燥的菌絲[7-8]，稱取0.05g左右的菌絲，在研缽中加入液氮充分研磨，加入1mL Tris提取液混勻[9]，然后再研磨5～6分鐘，然后在4℃冷凍離心機(jī)12000r/min離心10min，取上清液置于零下18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p>

42、<p>　　2.6.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及分析</p><p>　　提取得到的蛋白質(zhì)50μL與等量的樣品緩沖液混合在100℃的沸水中加熱煮沸10分鐘，用移液槍移取50μL進(jìn)行點(diǎn)樣，電泳初期使用120V的穩(wěn)壓電泳，當(dāng)進(jìn)入分離膠后電壓加到180V進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后取出膠板置于染色液中染色30min左右后進(jìn)行脫色，直到脫色到電泳帶非常明顯為止。</p><p><b

43、>　　電泳圖掃描方法</b></p><p>　　將脫色好的膠板放在玻璃板上進(jìn)行晾干后，放入GS-800 Calibrated Densitometer儀器內(nèi)，使用儀器掃描得到電泳圖。</p><p>　　電泳圖蛋白質(zhì)定量分析方法</p><p>　　將掃描后的電泳圖使用軟件Quantity one進(jìn)行電泳圖的分析[10]，在工具欄中Band中的D

44、eterct Bands對(duì)電泳圖進(jìn)行泳道的確立，然后使用工具欄中的Match中的Standards標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在電泳圖上標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置，最后使用Analysise輸入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的數(shù)值，創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，得到定量檢驗(yàn)報(bào)告。得到樣品、親本和融合后代的蛋白質(zhì)數(shù)值。</p><p>　　電泳圖蛋白質(zhì)帶分析方法</p><p>　　將掃描后的電泳圖使用軟件Quantity one進(jìn)

45、行電泳圖的分析，在使用工具欄中Volume Tools對(duì)電泳圖上的蛋白質(zhì)帶進(jìn)行標(biāo)記，勾畫出各電泳條帶的邊界。</p><p>　　電泳圖泳道及相似性列表分析方法</p><p>　　將掃描后的電泳圖在Quantity one軟件中的工具欄Band的中的Deterct Bands對(duì)電泳圖進(jìn)行泳道的確立，然后使用工具欄中的Match中的Standards標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)蛋白,在電泳圖上取一能包含大多數(shù)

46、的融合后代的條帶作為樣本，使用Match中的Match對(duì)融合條帶進(jìn)行調(diào)整，是使其在樣本范圍內(nèi)。最后使用工具欄上的Repoorts中的Conpare Lane Imgages生成相似性圖表。</p><p>　　電泳圖親本及其后代的聚類分析</p><p>　　經(jīng)Quangtity one軟件生成1－0圖表，在使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的聚合樹形分析得出分支樹形圖。</p>&l

47、t;p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 高產(chǎn)酶菌株的篩選</p><p>　　通過對(duì)融合后代高產(chǎn)酶菌株的觀察和分析，我們得到了米根1號(hào)、米根2號(hào)、米根3號(hào)三種高產(chǎn)酶菌株。</p><p>　　3.2 后代形態(tài)分析</p><p>　　3.2.1 平板培養(yǎng)基觀察結(jié)果</p>

48、<p>　　觀察斜面合平板上的菌落蔓延情況。疏松程度。是呈絨毛狀、棉絮狀還是蜘蛛狀，以及菌落和培養(yǎng)基的顏色、菌落中心合邊緣的顏色。對(duì)根霉、毛霉，可輕輕打開培養(yǎng)皿，將皿蓋（有菌的一面朝上）置于顯微鏡低倍鏡下直接觀察，觀察皿邊緣的菌絲。</p><p>　　圖1親本米曲霉 圖2親本根霉</p><p>　　圖3米根一代1

49、圖4米根一代2 圖5 米根一代3</p><p>　　圖6米根三代1 圖7米根三代2 圖8 米根三代3</p><p>　　圖9米根五代1 圖10米根五代2 圖11米根五代3</p><p>　　圖12米根

50、七代1 圖13 米根七代2 圖14米根七代3</p><p>　　通過觀察我們可以看到，菌落生長(zhǎng)較快，且比較密集，但顏色過渡較慢，最外圈為白色菌絲，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移菌絲變的越來越稀，且分生孢子逐漸增多，在菌落表面有少量絨毛。圖1,2為親本，圖1為親本米曲霉，初為白色，后其上密生一層綠色粉粒，中間顏色為黃色。從圖3到圖14是融合后代，親本和后代菌落生長(zhǎng)都較

51、快，且比較密集，形狀基本都接近圓形，但顏色過渡較慢，逐步呈現(xiàn)淡黃色，最外圈為白色菌絲，整體感覺光鮮明亮，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移菌絲變的越來越稀，且分生孢子逐漸增多，表面顏色開始變成淡的灰黑色，在菌落表面有少量絨毛。在圖9圖10中可以看到有大量分生孢子的產(chǎn)生。從平板反面看菌落呈黃色。</p><p>　　3.2.2 顯微鏡觀察結(jié)果</p><p><b>　　圖15米曲霉</b&

52、gt;</p><p>　　圖16米根一代1 圖17米根一代2 圖18米根一代3</p><p>　　圖19米根三代1 圖20米根三代2 圖21米根三代3</p><p>　　圖22米根五代1 圖23米根五代2 圖24米根五代

53、3</p><p>　　圖25米根七代1 圖26米根七代2 圖27米根七代3</p><p>　　從圖15中看出米曲霉的分生孢子頭放射狀，一直徑150～300μm，也有少數(shù)為疏松柱狀。分生孢子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)12～25μm，壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常40～50μm。小梗一般為單層，12～15μm，偶爾有雙層，也有單、雙層

54、小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生孢子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，老后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，一?.5μm，粗糙或近于光滑。圖16等中的胞子囊明顯的比圖15的小很多，除圖15外，其他圖中的胞子囊大小其本一致。</p><p>　　3.2.3 淀粉酶活觀察結(jié)果</p><p>　　圖28米根一代1 圖29米根一代2 圖30米根一代3</p>

55、<p>　　圖31米根三代1 圖32米根三代2 圖33米根三代3</p><p>　　圖34米根五代1 圖35米根五代2 圖36米根五代3</p><p>　　圖37米根七代1 圖38米根七代2 圖39米根七代3</p>

56、<p>　　3.2.4 蛋白酶活觀察結(jié)果</p><p><b>　　圖40米曲霉</b></p><p>　　圖41米根一代1 圖42米根一代2 圖43米根一代3</p><p>　　圖44米根三代1 圖45米根三代2 圖46米根三代3&l

57、t;/p><p>　　圖47米根五代1 圖48米根五代2 圖49米根五代3</p><p>　　圖50米根七代1 圖51米根七代2 圖52米根七代3</p><p>　　3.3 酶活測(cè)定結(jié)果與分析</p><p>　　3.3.1不同菌種的蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

58、與分析</p><p><b>　　表3親本蛋白酶活</b></p><p>　　表4融合一代蛋白酶活</p><p>　　表5融合三代蛋白酶活</p><p><b>　　續(xù)表5</b></p><p>　　表6融合五代蛋白酶活</p><p>　　

59、表7融合七代蛋白酶活</p><p>　　表8不同菌種的蛋白酶活</p><p>　　親本與融合菌株比較，融合五代1的酶活力最高，融合一代1酶活力則最低。通過表中的數(shù)據(jù)分析可知，親本及三代、五代與七代之間的蛋白酶活力并無顯著差異。在5％的顯著差異下，融合三代、融合五代和融合七代之間沒有明顯的差異，融合一代與融合三代、融合五代、融合七代有明顯的差異，親本根酶也與后代存在差異，在1％的顯著差異

60、下，親本米曲霉和根霉與后代有差異，融合三代、融合五代和融合七代之間無明顯差異，融合一代和融合三代、融合五代、融合七代存在明顯的差異。</p><p>　　3.3.2 不同菌種的淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果與分析</p><p><b>　　表9親本淀粉酶活</b></p><p>　　表10融合一代淀粉酶活</p><p>　　表

61、11融合三代淀粉酶活</p><p><b>　　續(xù)表11</b></p><p>　　表12融合五代淀粉酶活</p><p>　　表13融合七代淀粉酶活</p><p>　　表14不同菌種淀粉酶活</p><p>　　親本與融合菌株比較，融合一代的酶活力最高，親本酶活力次之，融合七代酶活力則最低

62、。通過表中的數(shù)據(jù)分析可知，親本及一代與三代之間的淀粉酶活力并無顯著差異。在5％的顯著差異下，親本與融合一代、融合三代之間沒有差異，融合七代與親本之間存在明顯的差異，在1％的顯著差異下，親本米曲霉和根霉與后代無明顯的差異。</p><p>　　3.4 SDS凝膠電泳</p><p>　　3.4.1 電泳掃描圖</p><p>　　使用GS-800 Calibrated

63、 Densitometer對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，得到掃描圖片。</p><p>　　注：圖中出現(xiàn)多余兩條條帶是因?yàn)闃悠凡粔?，還有兩個(gè)孔多，故重復(fù)點(diǎn)了兩個(gè)樣品點(diǎn)。</p><p>　　從上圖中可以發(fā)現(xiàn)同一代中的不同個(gè)體條帶差別很大，如融1b和融1c，融1c中條帶明顯且多條，而融1b中基本沒有，比較明顯和條帶多的還有融5b、融7a和融7c，比較不明顯的而且條帶很少的還有融1a和融5c。我認(rèn)為有以下幾

64、點(diǎn)導(dǎo)致條帶很少：第一，菌種本身有問題，染菌或者變異了；第二，在提取蛋白質(zhì)時(shí)，提取不夠充分研磨不完全，時(shí)間短；第三，在提取和離心過程中被污染或酶解；第四，電泳前，對(duì)樣品處理出現(xiàn)失誤或某些原因?qū)е碌鞍踪|(zhì)含量減少。有幾條條帶的顏色很深，我認(rèn)為是在離心時(shí)不夠徹底，樣品液中有固體小顆粒。圖中三條Marker出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，可能是溫度高，跑膠的時(shí)候由于膠板有電阻的原因，在跑膠時(shí)候發(fā)熱導(dǎo)致膠板發(fā)熱，所以Marker出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。</p>

65、<p>　　3.4.2 蛋白定量分析</p><p>　　從這張定量圖譜中我們可以看出，從親本的條帶顏色深度和融合后代的條帶顏色深度的比較中我們可以初步認(rèn)為融合體后代的蛋白含量普遍比較低。除了跟實(shí)驗(yàn)過程中蛋白質(zhì)的提取率有關(guān)外，也跟融合體本身的蛋白含量及融合情況也有直接的聯(lián)系，還有可能是實(shí)驗(yàn)操作過程中污染和變異也有關(guān)系。</p><p>　　3.4.3 定量檢驗(yàn)報(bào)告</p&g

66、t;<p>　　表15 標(biāo)樣蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　表16 米曲霉蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　表17 根霉蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p><b>　　續(xù)表17</b></p><p>　　表18 融合一代1蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　表19

67、 融合三代1蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　表20 融合五代1蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　表21 融合七代1蛋白定量檢驗(yàn)報(bào)告</p><p>　　觀察以上數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)，兩親本蛋白質(zhì)組的組成和含量與融合后代的蛋白質(zhì)組組成和含量存在差異性。如根霉第三泳道中電泳出14條帶，其中G1的Volume為0.9514670848，Adj. Vol.為0.

68、4979991422，% Adj. Vol.為0.3392922798，Mean Value為0.0832619244。在后代中如融合一代電泳得到8條條帶，其中A1的Volume0.6688410129，Adj. Vol.為0.2992182368，% Adj. Vol.為0.2038606679，Mean Value為0.0718064469。數(shù)據(jù)顯示本實(shí)驗(yàn)得到了不同于親本的融合體，且后代的變異很大，融合后各個(gè)后代的蛋白質(zhì)含量都普遍降

69、低。因此我們知道兩親本存在著相互排斥和制約，使得融合后代細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量都普遍降低。</p><p>　　從表中數(shù)據(jù)的比較中可以得出后代融合體之間蛋白質(zhì)組成也存在很大的不同，尤其是融合一代和融合三代之間的差異比較明顯。如融合一代中電泳得到6條帶，其中A1的Volume為0.6688410129，Adj. Vol.為0.2992182368，% Adj. Vol.為0.2038606679，Mean Value為

70、0.0718064469。在融合三代中電泳得到10條帶，其中E1中的Volume為1.0891937653，Adj. Vol.為0.5123582208，% Adj. Vol.為0.3490752776，Mean Value為0.0749294249。從這些數(shù)據(jù)中可以看出融合后代中有新的蛋白質(zhì)生成，在傳代過程有些融合后穩(wěn)定性不高的蛋白質(zhì)信息被逐步的去除掉。</p><p>　　3.5 蛋白質(zhì)帶分析</p&g

71、t;<p>　　運(yùn)用Quantity one軟件，對(duì)電泳圖譜進(jìn)行帶匹配操作，在完成該操作后得到了帶匹配圖譜。</p><p>　　注：在帶匹配圖譜中，綠色的帶表示被定義的帶，紅色的帶則表示與之相匹配的帶。2、3為親本，1、4、5為融合一代，6、7、11為融合三代，12,、13、14為融合五代，15、16、17為融合七代。</p><p>　　3.6 泳道中帶分布報(bào)告</

72、p><p>　　表22 帶分布報(bào)告表</p><p><b>　　續(xù)表22</b></p><p><b>　　續(xù)表22</b></p><p>　　注：Matching Tolerance為4.00%。表中0表示沒有該條帶，1表示有該條帶。</p><p>　　表23 帶分

73、布報(bào)告表</p><p><b>　　續(xù)表23</b></p><p><b>　　續(xù)表23</b></p><p>　　注：Matching Tolerance為4.00%。表中0表示沒有該條帶，1表示有該條帶。</p><p>　　從圖表中分析中我們可以知道，在融3b、融5c、融7a、融7b、融

74、7c中出現(xiàn)了2號(hào)新蛋白，在融1b、融7b中出現(xiàn)了3號(hào)新蛋白，在融1b、融5c、融7a、融7b中出現(xiàn)了11號(hào)新蛋白，在融1a、融5c中出現(xiàn)了12號(hào)新蛋白，在融1a、融1b、融7c中出現(xiàn)了13號(hào)新蛋白，在融1a、融7b中出現(xiàn)了17號(hào)新蛋白，在融1b、融3b、融3c、融5a、融7a、融7c中出現(xiàn)了22號(hào)新蛋白，在融1a、融3b、融5b中出現(xiàn)了26號(hào)新蛋白，在融1a、融1b、融5a、融5b、融5c、融7a中出現(xiàn)了了27號(hào)新蛋白，在融3b、融5a

75、、融5b、融5c、融7b中出現(xiàn)了31號(hào)新蛋白，在融1a、融1c、融3b、融5c中出現(xiàn)了32號(hào)新蛋白，在融1a、融1c、融3a、融7b中出現(xiàn)了33號(hào)新蛋白，在融1a、融7b中出現(xiàn)了34號(hào)新蛋白，在融1a、U6-10、U10-24中出現(xiàn)了35號(hào)新蛋白；在融1c、融3a、融5c中出現(xiàn)了39號(hào)新蛋白，在融5c中出現(xiàn)了40號(hào)新蛋白，在融1c、融3a、融5c中出現(xiàn)了41號(hào)新蛋白，在融1b、融1c、融3a中出現(xiàn)了42號(hào)新蛋白，在融1a、融1c、融5c

76、中出現(xiàn)了43號(hào)新蛋白，在融1c中出現(xiàn)了44好新蛋白，在融</p><p>　　從后代之間的比較中，我們可以發(fā)現(xiàn)三代和五代中的蛋白差異比較大，一些原本含有的蛋白在傳代過程中消失了，傳代的融合體中基本條帶都比較穩(wěn)定，但在融3c、融5a、融5b中出現(xiàn)比較大的波動(dòng)，通過分析可能是在培養(yǎng)過程中受到污染的原因，或者是出現(xiàn)了變異的情況。也有可能是在電泳中點(diǎn)樣的時(shí)候多種樣品混在一起出現(xiàn)的情況。</p><p&

77、gt;　　因此認(rèn)為米曲霉和根霉的融合過程是比較易實(shí)現(xiàn)的，但與親本的差異很大。親本中的蛋白質(zhì)一部分在后代融合體已經(jīng)不存在。后代中又有少量的變異情況，可能需要更進(jìn)一步的傳代培養(yǎng)以得到更穩(wěn)定的后代。而且我們不難發(fā)現(xiàn)在根霉中含有的蛋白質(zhì)條帶，在融合體中分布率明顯要比毛霉高，這說明根霉的遺傳穩(wěn)定性在后代融合體中比毛霉好的多，且融合中的遺傳物質(zhì)主要來至根霉。</p><p>　　3.6 列相似性分析</p>&

78、lt;p>　　3.6.1 相似性圖表</p><p>　　Quantity one軟件提供了多種方式來比較列相似性，列相似性圖表和列相似性報(bào)表，都以最直觀的方式反映列相似性。</p><p><b>　　圖53 相似性圖標(biāo)</b></p><p>　　從圖中我們可以看到電泳圖譜中各列的條帶在數(shù)量以及電泳遷移距離上的區(qū)別。正如上述表格數(shù)據(jù)以

79、及圖片分析，我們電泳得到了61種不同的蛋白質(zhì)條帶，兩個(gè)親本個(gè)體中的蛋白組的組成和含量與融合體的蛋白組組成和含量都存在很大的差異。兩親本的相似度為42.3％，而在后代融合體中相似度有所提高，說明融合得到了新的菌株。</p><p>　　3.6.2 親本及其后代的聚類分析</p><p>　　根據(jù)帶分布報(bào)告，此圖反映的是各列（菌體）之間的差異性。</p><p>　　圖

80、54 Jaccard(1901)相異系數(shù)</p><p>　　從圖中可分析，融合后代一部分趨向于與根霉的一個(gè)種，一部分趨向與米曲霉的一個(gè)種，但彼此間差異比較大。在趨向于與根霉的一個(gè)種中比較明顯的是融1a，我們可以認(rèn)為與根霉是同一個(gè)種，且與米曲霉也有一定的相似性。在趨向于與米曲霉的一個(gè)種中比較明顯的是融3c，我們可以認(rèn)為與米曲霉是同一個(gè)種，且與根霉也有一定的相似性。融1c和融3a與米曲霉和根霉存在著差異，但不屬于同

81、一個(gè)種。在后代之中，融5代和融7代比較相似，相對(duì)比較明顯的差異應(yīng)該是融1代和融3代。</p><p><b>　　4 小結(jié)</b></p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)我們采用親本米曲霉、根霉、米根1號(hào)、米根2號(hào)、米根3號(hào)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分析得到的融合后代，我們認(rèn)為后代與親本之間存在一定的差異。從各酶活的結(jié)果中可以看出后代的酶活都比親本的低且傳代越多酶活越低，我們認(rèn)為兩親本融合

82、影響其酶活在后代中的表達(dá)，且傳代會(huì)繼續(xù)影響酶活的表達(dá)。融合后代產(chǎn)生新的蛋白條帶，同時(shí)也失去了一些在親本中存在的蛋白質(zhì)，原因是因?yàn)橄У牡鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性差，不能在后代中表達(dá)，還有一些蛋白質(zhì)在后代和親本都存在，說明在后代中存在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好。后代的蛋白質(zhì)含量普遍比親本的要低，而且條帶分布也比較親本少，但是保留了其中一些親本的主要特性。在后代和后代的比較之間中我們認(rèn)為伴隨著傳代的進(jìn)行，其蛋白含量也有所減少，條帶也逐漸減少，但主要幾個(gè)條在遺傳中帶表

83、現(xiàn)的很穩(wěn)定。出現(xiàn)穩(wěn)定且遺傳性較好的條帶都來自根霉。</p><p>　　對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)操作我們還要改進(jìn)，為以后的進(jìn)一步研究做鋪墊：</p><p>　?。?）接種的問題，要注意到染菌的問題，在潔凈工作臺(tái)接種的時(shí)候要用酒精棉擦工作臺(tái)，不要讓菌污染；在用接種環(huán)接種，不要在酒精燈上燒太久，不然接種環(huán)接種時(shí)會(huì)使?fàn)C死菌種。</p><p>　?。?）培養(yǎng)基厚度問題：第二次制作培

84、養(yǎng)基時(shí)，由于倒的量不夠，培養(yǎng)皿中基質(zhì)缺乏而導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)緩慢，影響進(jìn)度。</p><p>　?。?）蛋白質(zhì)的提?。簩?duì)于菌絲要研磨碎，不然只能提取很少的蛋白質(zhì)的量，這樣會(huì)在電泳時(shí)跑出的蛋白質(zhì)很少甚至沒有。開始做的時(shí)候由于研磨不夠充分導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法提取出來，影響電泳結(jié)果。</p><p>　　（4）制作膠板問題：由于大膠板沒有制膠槽，所以要自己有瓊脂糖溶液進(jìn)行封膠，由于技術(shù)不夠封膠一直封不好，總

85、是漏水，經(jīng)多次嘗試和改進(jìn)后終于總結(jié)出了一個(gè)適合我們的封膠方法，才得以順利的電泳。制膠的時(shí)候要注意不要出現(xiàn)氣泡，我們之前由于制膠出現(xiàn)氣泡，耽誤了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。</p><p>　?。?）要注意點(diǎn)樣的問題，使樣品液注入到膠孔下面。跑電泳的時(shí)候因?yàn)槟z板有電阻，電流進(jìn)過時(shí)會(huì)發(fā)熱，導(dǎo)致整塊膠發(fā)熱，出來的結(jié)果就不是很好，因注意要用低電壓跑電泳。</p><p>　　影響實(shí)驗(yàn)的因素還有很多，我們一一克服，

86、對(duì)于以上的一些問題，我們?cè)谝院蟮难芯繒?huì)更加重視。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 辛明秀,蔣亞平. 米曲霉原生質(zhì)體融合及雜合二倍體的形成[J].微生物學(xué)通報(bào),1994,21(3):143～147.</p><p>　　[2] Ito Hi. Nessa A[J]. Radiation Physics a

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90、-70.</p><p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)書</p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因改組后代酶活力和形態(tài)特性變化規(guī)律研究</p><p><b>　　畢業(yè)論文開題報(bào)告</b></p><p><b>

91、;　　生物工程</b></p><p>　　根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因改組后代酶活力和形態(tài)特性變化規(guī)律研究</p><p>　　1. 課題研究意義及國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p><p>　　米曲霉菌落生長(zhǎng)快，10d直徑達(dá)5～6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品

92、醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會(huì)引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變。米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生

93、產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1000多年。米曲霉是理想的生產(chǎn)大腸桿菌不能表達(dá)的真核生物活性蛋白的載體。米曲霉基因組所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。米曲霉基因組的破譯，也為研究由曲霉屬真菌引起的曲霉病提供了線索。</p><p>　　除了細(xì)菌以外，根霉是迄今為止絲狀菌中產(chǎn)L乳酸的另一重要菌種。根霉菌是真核生物,其核有核膜包圍,具各種細(xì)胞器.

94、基因結(jié)構(gòu)中編碼區(qū)不連續(xù)有內(nèi)含子，根霉菌分布廣，約10種以上。通常對(duì)人無害，食用甜酒藥及糖化飼料就是選用此菌制備的。根霉菌為條件致病菌?？梢鹗称访棺?，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染。致開門見山的有匍枝根霉、小孢根霉、少根根霉和米根霉等?？梢鹈咕?，蜂窩組織炎等。根霉、米曲霉原生質(zhì)體雙親融合后代第1-7代各后代的菌落、菌體形態(tài)特征的觀察、分析，通過對(duì)各后代蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS電泳等多種方法測(cè)定、分析，同親本相比較，得出融合后代

95、的形態(tài)特征、生理生化特性和穩(wěn)定性等遺傳特性和變化規(guī)律。</p><p>　　對(duì)兩種霉的原生質(zhì)體融合后代進(jìn)行進(jìn)一步的研究，經(jīng)人工培養(yǎng)多代后進(jìn)行雜交試驗(yàn)，觀察菌株的形態(tài)特征、部分生理生化形態(tài)分析以及的分析，為得到品種更優(yōu)秀的，有利遺傳更穩(wěn)定的，作用范圍更廣的后代作鋪墊。</p><p>　　2. 課題研究的主要內(nèi)容、預(yù)期目標(biāo)和研究方案</p><p><b>

96、　　主要內(nèi)容：</b></p><p>　　1.菌體培養(yǎng)基的制備、滅菌，親本菌種的雜交。</p><p>　　2.雜交代多個(gè)后代菌株進(jìn)行形態(tài)特征分析。</p><p>　　3.雜交代后代1、3、5、7蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS電泳。</p><p><b>　　預(yù)期目標(biāo)</b></p&g

97、t;<p>　　1.獲得米曲霉、根霉融合后代菌株進(jìn)行形態(tài)生理生化分析，了解后代遺傳形態(tài)</p><p>　　2.獲得米曲霉、根霉融合后代菌株進(jìn)行蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS電泳，得出數(shù)據(jù)于各個(gè)菌株進(jìn)行比較。</p><p><b>　　研究方案：</b></p><p>　　1 菌種的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)：YPD培養(yǎng)基活化

98、菌種，PDA培養(yǎng)基擴(kuò)大菌種。</p><p>　　1.1 將準(zhǔn)備好的菌種在無菌室超凈工作臺(tái)上接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，澆制2到3個(gè)。將接種好的培養(yǎng)基倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3—5天。</p><p>　　2 菌落形態(tài)特征的觀察</p><p>　　2.1 觀察平板培養(yǎng)基上菌落蔓延狀況、疏松程度，表面濕潤(rùn)或干燥，有無光澤，隆起形狀,邊緣的整齊度、大小、顏色等。

99、</p><p>　　3 菌體形態(tài)特征的觀察</p><p>　　3.1 顯微鏡觀察菌種的形狀及出芽方式。</p><p><b>　　4 蛋白酶活力測(cè)定</b></p><p>　　4.1在超凈工作臺(tái)上用接種針挑取每個(gè)菌落接種到PDA培養(yǎng)基上分離純化，每個(gè)培養(yǎng)基放3-5個(gè)，25℃培養(yǎng)24h。將分離后的菌落，用直徑2mm

100、的吸管戳4個(gè)小區(qū)域。每個(gè)菌落用接種針挑3個(gè)接種到酪蛋白培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h，48h分別觀察透明圈大小，并計(jì)算蛋白酶活力。</p><p><b>　　5 淀粉酶活力測(cè)定</b></p><p>　　5.1在超凈工作臺(tái)上用接種針挑取每個(gè)菌落接種到PDA培養(yǎng)基上分離純化，每個(gè)培養(yǎng)基放3-5個(gè)，25℃培養(yǎng)24h。將分離后的菌落，用直徑2mm的吸管戳4個(gè)小區(qū)域。每個(gè)菌落

101、用接種針挑3個(gè)接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h，48h后滴加盧戈氏碘液分別觀察透明圈大小，并計(jì)算淀粉酶活力。</p><p>　　盧戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。</p><p>　　6 SDS電泳：通過SDS電泳測(cè)定蛋白質(zhì)種類和蛋白質(zhì)分子量。</p><p&

102、gt;　　6.1制膠板的安裝（短玻璃面朝內(nèi)），要求密封，以免膠液泄漏。配制適量（如7.5ml）的一定濃度的分離膠，將配制好的分離膠加入制膠槽中，注意應(yīng)隨著邊緣緩慢加入，千萬別</p><p>　　進(jìn)氣泡。凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒0.5cm處。輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層雙蒸水封膠，使凝膠表面變得平整，靜放30min～1小時(shí)，使凝膠聚合。除去上面的水層，再用濾紙吸盡殘留的液體。配制5%的濃縮膠（

103、3ml）迅速將配制好的濃縮膠添加到分離膠表面，并將梳子插入凝膠內(nèi)，至梳子齒的底部與前玻璃板的頂部平齊，小心避免混入氣泡。將凝膠垂直放置于室溫下，約30min凝膠聚合。凝膠聚合后，即可進(jìn)行電泳。電泳、染色和脫色。</p><p><b>　　3.課題進(jìn)度計(jì)劃</b></p><p>　　2010年11月—2010年12月 文獻(xiàn)檢索，收集資料，完成開題報(bào)告</p

104、><p>　　2010年12月—2011年1月 菌絲的培養(yǎng)及提取</p><p>　　2011年2月—2011年3月 進(jìn)行蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、SDS電泳的實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2011年3月— 2011年4月 畢業(yè)論文的初稿</p><p>　　2011年5月 完成畢業(yè)論文</p&

105、gt;<p><b>　　4. 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Hopwood D A , Wright H M. Genetic recombination through protoplast fusion in Streptomyces [J]. J Gen Microbiol , 1979, 111(1): 137-143.</p><

106、p>　　[2] 梁平彥,劉宏迪 .展青霉和產(chǎn)黃青霉的種間體細(xì)胞雜交[J].微生物學(xué)報(bào),1982,22(3):248-256.</p><p>　　[3]彭幫柱，岳田利，袁亞宏等.酵母菌原生質(zhì)體融合技術(shù)[J]西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（1）：101-103</p><p>　　[4]王燕.熱-紫外滅活雙親原生質(zhì)體融合選育米曲霉新菌株的研究[J]中國(guó)釀造，2008，19：42-44&l

107、t;/p><p>　　[5]李立風(fēng),潘力,彭昶,葉燕銳.基因組改組:幾株同源醬油曲霉的多親株電融合育種[J]中國(guó)調(diào)味品2007，7：14-18</p><p>　　[6]王國(guó)良.對(duì)小猿葉甲高毒力煙曲霉菌株的選育技術(shù)[J]中國(guó)生物防治，2008，24(2)：182-185</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p>&

108、lt;p><b>　　生物工程</b></p><p>　　微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)</p><p>　　摘要：用根霉和米曲霉兩種菌株為親本菌株，分別用纖維素酶和蝸牛酶、溶菌酶的混合酶液制得了兩個(gè)親本的原生質(zhì)體。在研究了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)方法、酶解時(shí)間、酶解液的配比等條件對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量影響的基礎(chǔ)上，以PEG誘導(dǎo)進(jìn)行原生質(zhì)體的融合，并進(jìn)行紫外線照射的誘變育種。通過比較在

109、菌落外觀、顏色及形態(tài)上與米曲霉和根霉菌株的不同，以及進(jìn)行高酶活篩選，獲得一株具有較高酶活力的新菌株。</p><p>　　關(guān)鍵詞：米曲霉；根霉；原生質(zhì)體制備；融合；篩選</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　近年來，隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，原生質(zhì)體融合技術(shù)已成功的應(yīng)用于微生物的遺傳育種中。原生質(zhì)體融合技術(shù)的

110、特點(diǎn)是不依賴微生物自身的結(jié)合能力，而是將雜交的兩個(gè)親本菌株通過酶解作用除去細(xì)胞壁的高滲環(huán)境中，釋放只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體[1]，然后在特定的條件下促使其互相融合，進(jìn)而使兩個(gè)親本菌株的遺傳物質(zhì)之間發(fā)生接觸、交換來產(chǎn)生重組體，并通過使原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁，獲得重組子。原生質(zhì)體融合的基因重組頻率不僅比一般雜交高，而且可將重組的范圍由種內(nèi)擴(kuò)大到種間甚至屬間。</p><p>　　1 原生質(zhì)體融合技術(shù)</p&

111、gt;<p>　　原生質(zhì)體融合技術(shù)(protoplast fusion)又稱為細(xì)胞融合技術(shù)，是指用酶的方法除去細(xì)胞壁，制成由原生質(zhì)膜包裹的原生質(zhì)體，然后采用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合，發(fā)生染色體交換、重組從而達(dá)到雜交的目的，并篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定重組體的一種育種方法[2]。微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)是通過改變微生物細(xì)胞的遺傳性進(jìn)行育種，其可以在種內(nèi)、屬內(nèi)、屬間甚至跨界進(jìn)行，并且在各