根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組后代酶活力和發(fā)酵酒釀特性研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　根霉與米曲霉原生質(zhì)體一次基因組改組后代酶活力和發(fā)酵酒釀特性研究</p><p><b>　　摘

2、 要</b></p><p>　　本實驗通過對根霉與米曲霉原生質(zhì)體進(jìn)行一次基因組改組融合后代的發(fā)酵酒釀特性和穩(wěn)定性等遺傳特性和變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）所有菌株所制曲種的酶活力，都是以兩個親本的最高。在蛋白酶活力上各菌株三代的普遍高于其五代，在糖化酶活力上除了根3和米根3代A酶活力低于其五代酶活力外其他均表現(xiàn)出3代高于5代。在酶活力上親本與融合菌株間有顯著差異，各菌株3代與5代間無顯著差異。（

3、2）在發(fā)酵產(chǎn)品的檢測上，米根5A發(fā)酵效果最好，酒精濃度是15.37%；兩個親本之間相對差不多，分別為13.4%和12.5%；在子代中，3代的發(fā)酵效果要比5代的高。（3）酒糟中的風(fēng)味物質(zhì)，以雜環(huán)化合物和醇類最多，酯類次之，酚、醛類較少。</p><p>　　關(guān)鍵詞：米曲霉；根霉；基因組改組；原生質(zhì)體；融合；發(fā)酵；酒釀</p><p><b>　　ABSTRACT</b>

4、</p><p>　　Through this study, Rhizopus and Aspergillus oryzae protoplasts with a Genome shuffling, analysis, integration of future generations come to the fermentation characteristics and stability of fermen

5、ted rice and other genetic characteristics and variation. The results showed that: (1) All kinds of strains of the koji enzyme activity, are the highest in the female parent.In three generations of each strain on proteas

6、e activity generally higher than Five, in addition to the glucoamylase activity of </p><p>　　Key words:Aspergillus oryzae;Rhizopus; Genome shuffling ;protoplast; integration; fermentation;fermented rice</

7、p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料和方法1</b></p><p>　　2.1 材料、試劑與設(shè)備1</p><p>　　2.1.1 材料............

8、...................................................................................................1</p><p>　　2.1.2 主要化學(xué)藥品與試劑.................................................................................

9、..2</p><p>　　2.1.3 主要儀器與設(shè)備...........................................................................................2</p><p>　　2.2 酒釀的制造工藝2</p><p>　　2.2.1 主要工藝..................

10、.....................................................................................2</p><p>　　2.2.2 工藝的操作要點...........................................................................................3<

11、/p><p>　　2.3菌種活化及經(jīng)一次基因改組后原生質(zhì)體的融合...............................................3</p><p>　　2.3.1菌株活化3</p><p>　　2.3.2原生質(zhì)體的一次基因改組融合3</p><p>　　2.4 曲種及酒釀的制備3</p><

12、;p>　　2.4.1 不同菌種制曲前培養(yǎng)...................................................................................3</p><p>　　2.4.2 不同菌種曲種的制備..........................................................................

13、.........4</p><p>　　2.4.3 不同菌種發(fā)酵酒釀的制備...........................................................................4</p><p>　　2.5 理化分析方法4</p><p>　　2.5.1 不同菌種曲種中相關(guān)物質(zhì)的測定..............

14、.................................................4</p><p>　　2.5.2 不同菌種發(fā)酵酒釀中相關(guān)物質(zhì)的測定......................................................5</p><p><b>　　3 結(jié)果分析7</b></p><p&

15、gt;　　3.1 不同菌種對曲種的影響7</p><p>　　3.1.1 不同菌種對曲種蛋白酶活力的影響...........................................................7</p><p>　　3.1.2 不同菌種對曲種糖化酶活力的影響..................................................

16、.........8</p><p>　　3.2 不同菌種對酒釀物質(zhì)的影響9</p><p>　　3.2.1 不同菌種對酒釀中乙醇含量的影響.........................................................9</p><p>　　3.2.2 不同菌種對酒釀中甲醇含量的影響.....................

17、....................................10</p><p>　　3.2.3 不同菌種對酒釀中糖度的影響.................................................................12</p><p>　　3.2.4 不同菌種對酒釀中酸度的影響.............................

18、....................................12</p><p>　　3.2.5 不同菌種對酒釀中蛋白含量的影響.........................................................13</p><p>　　3.2.6 不同菌種對酒糟中風(fēng)味物質(zhì)的影響.................................

19、........................14</p><p><b>　　4 結(jié)論16</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)18</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　酒釀是中國的傳統(tǒng)食品，其富含糖類、蛋白質(zhì)等，是一種滋

20、補性營養(yǎng)食品，經(jīng)常食用酒釀不僅能促進(jìn)攝取營養(yǎng)，而且還能促進(jìn)血液循環(huán)，增進(jìn)食欲，增強體質(zhì)，其功效為活血行經(jīng)，散結(jié)消腫，發(fā)痘疹，托瘡毒，性善竄透。米曲和根霉是發(fā)酵酒釀中主要的微生物。米曲霉（Aspergillus oryzae）是釀造業(yè)中的重要微生物，其生長過程中分泌的蛋白酶和谷氨酰胺酶等對醬油、豆瓣、米酒等的產(chǎn)率和風(fēng)味起著非常重要的作用。然而在生產(chǎn)實踐中，蛋白酶活性高的米曲霉菌株通常生長速度很慢；而生長速度快的米曲霉菌株蛋白酶活性很低[

21、1]。根霉是霉菌中一種具有多酶系特征的霉菌，它能分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多種有機酸和乙醇等，可以在整個發(fā)酵過程中始終邊糖化邊發(fā)酵連鎖進(jìn)行。食品釀造工業(yè)中所用的主要原料，多數(shù)含有較多的淀粉，根霉能產(chǎn)生豐富的淀粉酶，使淀粉變?yōu)樘欠郑哂泻芎玫奶腔阅?，是釀酒工業(yè)上常用的糖化菌[2]。米曲霉和根霉基因改組融合可克服單米曲發(fā)酵的蛋白酶活性低生長快而蛋白酶活性高的生長快的缺陷，使酒釀等發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味獨特，產(chǎn)率高，營養(yǎng)價值高。&

22、lt;/p><p>　　基因組改組技術(shù)能優(yōu)化大多數(shù)工業(yè)產(chǎn)物的代謝途徑和表型，操作直接，時間短，非常適合于工業(yè)應(yīng)用。由于重組得到的菌株和基因修飾的有機體是不同的, 可以直接用于食品工業(yè)[3] 。自然選育、誘變育種和雜交育種屬于傳統(tǒng)的誘變育 種方法。盡管傳統(tǒng)的誘變育種方法曾經(jīng)發(fā)揮著巨大的作用，但具有周期長、操作繁冗的缺點，且經(jīng)連續(xù)多次誘變后, 易出現(xiàn)產(chǎn)量無法提升的“疲勞效應(yīng)” ?；蚬こ逃?/p>

23、種雖有目標(biāo)明確、定向性好的優(yōu)點，但需要對目的菌株的遺傳背景有著比較深刻的了解，故相當(dāng)耗時、費力。基因組改組技術(shù)則可有效地解決上述方法的缺點，所以基因改組技術(shù)具備(1)節(jié)省時間，設(shè)備簡單(2)多親本的基因水平轉(zhuǎn)移(3)無須對菌種遺傳背景十分清楚，有效地對由“多基因” 調(diào)控的性狀進(jìn)行改良的優(yōu)點為微生物育種提供了新的手段。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p>

24、<p>　　2.1 材料、試劑與設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　原料：米飯、土豆、甜酒曲等均購于寧波市場。</p><p>　　菌種：米曲，根霉菌株由老師提供，將米曲霉和根霉菌株進(jìn)行基因改組融合后的第一代進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到米根融合菌株3代（以下均簡稱米根3A，3B），米根融合菌株5代（以

25、下均簡稱米根5A，5B），米曲親本菌株3代，5代（以下均簡稱米3，5），根霉親本菌株3代，5代（以下均簡稱根3，根5）。</p><p>　　2.1.2 主要化學(xué)藥品與試劑</p><p>　　主要化學(xué)藥品和試劑見表1。</p><p>　　表1 主要化學(xué)藥品與試劑</p><p>　　2.1.3 主要儀器與設(shè)備</p>&l

26、t;p>　　主要儀器和設(shè)備見表2。</p><p>　　表2 主要儀器與設(shè)備</p><p>　　2.2 酒釀的制造工藝</p><p>　　2.2.1 主要工藝</p><p>　　菌種接種→擴大培養(yǎng)→制曲</p><p><b>　　↓</b></p><p>

27、　　大米→清洗→浸泡→洗米→蒸飯→拌曲→發(fā)酵→甜酒釀</p><p>　　2.2.2 工藝的操作要點</p><p>　?。?）擴大培養(yǎng)：將準(zhǔn)備好的菌種在無菌超凈工作臺上接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，28~30℃下培養(yǎng)3代。</p><p>　?。?）制曲：將培養(yǎng)至第三代的菌種在無菌超凈工作臺上接種于裝有煮熟的米飯和水的已滅過菌的培養(yǎng)基中。</p><

28、;p>　　（3）曲種干燥：將制好的曲種風(fēng)干，備用。</p><p>　?。?）浸泡：將大米清洗干凈后，用容器加水浸泡。一般浸泡約12h[4] 。</p><p>　?。?）拌曲：曲種與蒸熟的米飯攪拌混勻并放置于有蓋的容器中。不同菌種之間的曲種的量要一致，米飯的量也要一致。在拌曲前，須留少許曲種，用于最后撒在拌曲后的米飯上。</p><p>　?。?）發(fā)酵：將拌

29、曲后的米飯放置于28~30℃下發(fā)酵，并隔一段時間打開容器的蓋子。若米飯過干而不能發(fā)酵，則可以加少量的水。</p><p>　　2.3菌種活化及經(jīng)一次基因改組后原生質(zhì)體的融合</p><p>　　2.3.1菌株活化 </p><p>　　菌株活化：在無菌環(huán)境下，將已滅菌的PDA培養(yǎng)基傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，制成平板；待其冷卻凝固后，用無菌接種針分別蘸取少量保藏的米

30、曲霉菌種和根霉菌種，采用“三點法”點種于平板上，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)5天。</p><p>　　2.3.2原生質(zhì)體的一次基因改組融合</p><p>　?。?）菌絲體培養(yǎng)：于無菌室的無菌環(huán)境下，將活化好的菌株接種入已經(jīng)滅過菌的盛有約30mL液體菌絲培養(yǎng)基的搖瓶中，之后放入30℃，轉(zhuǎn)速為120rad/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)18h。（2）原生質(zhì)體制備菌絲重量的1.5倍就是酶解液的量，酶解

31、液為混合酶液，蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶[5]以一定的濃度混合，用滲透壓穩(wěn)定劑配制而成。酶液的配置要當(dāng)天配當(dāng)天用。（3）用15W國產(chǎn)紫外線燈管,照射距離30cm ,各取5mL原生質(zhì)體懸浮液懸浮于無菌平皿中進(jìn)行5min的滅活處理或者置于于60℃恒溫水浴箱中熱滅活15min，用PEG誘導(dǎo)融合或者放入離心機中進(jìn)行融合，將融合后的米根融合后代接種于再生培養(yǎng)基上作為融合后的第1代。</p><p>　　2.4 曲種及酒釀的制

32、備</p><p>　　2.4.1 不同菌種制曲前培養(yǎng)</p><p>　　分別用5mm接種棒在米曲親本、根霉親本、米根融合菌株A,B一代的培養(yǎng)基上打3個孔，將3個孔所包含的菌種接種到各自的培養(yǎng)基上，放置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)1d，即一代，1d后把各個菌種接種到另一個無菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如此反復(fù)，培養(yǎng)至三代。</p><p>　　2.4.2 不同菌種曲種的制備&

33、lt;/p><p>　　將米蒸熟成米飯后，分裝與培養(yǎng)瓶中。放入高壓滅菌鍋內(nèi)在121℃條件下滅菌40min，排氣，降溫，取出，趁熱馬上將瓶內(nèi)米飯抖散，冷至30℃左右[6]。取冷卻后的培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺前用5mm接種棒分別在米3代親本、米5代親本、根3代親本、根5代親本、米根3代A、米根3代B、米根5代A、米根5代B的培養(yǎng)基上打3個孔，將3個孔中包含的菌種接種于裝有米飯的培養(yǎng)瓶中，放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，并不時觀

34、察。等到完成后,放于智能人工氣候箱中烘干。</p><p>　　2.4.3 不同菌種發(fā)酵酒釀的制備</p><p>　　通過對親本及一代的菌株的蛋白酶活力、糖化酶活力的比較，得出親本及一代與三代間相對較好的曲種，即米3代親本、米5代親本、根3代親本、根5代親本、米根3代A、米根3代B、米根5代A、米根5代B進(jìn)行酒釀發(fā)酵，并與購于市場的甜酒曲同時發(fā)酵，予以比較。制備酒釀時，取米飯150g，各

35、個菌種的曲種3g，在培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)約14d后觀察。</p><p>　　2.5 理化分析方法</p><p>　　2.5.1 不同菌種曲種中相關(guān)物質(zhì)的測定</p><p>　　測定不同菌種制曲后的曲種酶活力。蛋白酶活力使用福林酚法測定，糖化酶活力使用碘量法測定，并比較不同菌種間數(shù)據(jù)的同異。使用Duncan新復(fù)極差法分析蛋白酶活力和糖化酶活力的測定結(jié)果。</

36、p><p>　　2.5.1.1 不同菌種蛋白酶活力的測定</p><p>　　制備酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取充分研細(xì)各個菌種的曲種5g，稀釋20倍，測定吸光度，平行測定3次。酶活力單位是指在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的微克（μg）數(shù)[7]。</p><p>　　蛋白酶活力(U)=(A/10)×4×N×1/(1-W

37、)</p><p>　　式中：A——由樣品測得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)（或OD值×K）；</p><p>　　4——4mL反應(yīng)液取出1mL測定（即4倍）；</p><p>　　N——酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10——反應(yīng)10min；</p><p>　　W——樣品水分百分含量。<

38、;/p><p>　　2.5.1.2 不同菌種糖化酶活力的測定</p><p>　　稱取各個菌種的曲種5.0g，用的乙酸緩沖液定容至25mL，搖勻。通過4層紗布過濾。于甲、乙兩支50mL比色管中，分別加入可溶性淀粉25mL及緩沖液5mL，搖勻后，于40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）中加入待測酶液2mL，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立刻各加入氫氧化鈉溶液0.2mL，搖勻，將兩

39、管取出迅速冷卻，并于乙管（空白）中補加待測酶液2mL，吸取上述反應(yīng)液與空白液5mL，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘溶液10mL，再加氫氧化鈉溶液15mL，搖勻，密塞，于暗處反應(yīng)15min。取出，加硫酸溶液2mL，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至藍(lán)色剛好消失為其終點[8]，平行測定3次。</p><p>　　糖化酶活力(U/g)＝(A-B)c×90.05×32.2/5×1/2×

40、;n×2＝579.9×(A-B)c×n式中：</p><p>　　A——空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；</p><p>　　B——樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；</p><p>　　c——硫代硫酸鈉溶液的濃度，mol/L；</p><p>　　90.05——與1mL硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mol/L）相

41、當(dāng)?shù)囊詆表示的葡萄糖的質(zhì)量；</p><p>　　32.2——反應(yīng)液的總體積，mL；</p><p>　　5——吸取反應(yīng)液的體積，mL；</p><p>　　1/2——吸取酶液2mL，換算為1mL；</p><p><b>　　n——稀釋倍數(shù)；</b></p><p>　　2——反應(yīng)30min，換

42、算成1h的酶活力系數(shù)所得的結(jié)果表示至整數(shù)。</p><p>　　2.5.2 不同菌種發(fā)酵酒釀中相關(guān)物質(zhì)的測定</p><p>　　待酒釀發(fā)酵約14d后，酒釀過濾酒糟，取濾液測定酒釀中乙醇含量、甲醇含量、糖度、酸度、蛋白等含量，部分測定結(jié)果用Duncan新復(fù)極差法分析。其中，乙醇含量使用指示劑法測定，甲醇含量使用品紅-亞硫酸法測定，糖度使用斐林法測定，酸度使用滴定法測定，蛋白含量使用福林酚法

43、測定，并取酒糟通過質(zhì)譜儀測定風(fēng)味物質(zhì)。</p><p>　　2.5.2.1 不同菌種酒釀中乙醇含量的測定</p><p>　　制備乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0%，2.50%，5.00%，10.00%，20.00%，30.00%），各吸取10.0mL于25mL 比色管中，分別加入乙酸－乙酸銨緩沖液（PH3.2）10.0 mL，10g/L甲基橙溶液2.0 mL，用水定容、搖勻、放置5min，以水作參比，在

44、520nm波長處用1cm比色皿，分別測定溶液的吸光度差ΔA，得出ΔA與乙醇濃度的關(guān)系曲線。取18支刻度一致的25mL比色管中，其中9支分別加入各個菌種酒釀濾液5.0mL，按以上方法操作測定吸光度A樣。另外9支不加，再依次分別加入乙酸-乙酸銨緩沖溶液10.0mL，用水定容，搖勻，放置5min，用1cm比色皿于520nm波長處測定樣品空白A空白，同時測試劑空白A0 。吸光度差值ΔA = A0-A樣-A空白，平行測定3次[9]。</p&

45、gt;<p>　　2.5.2.2 不同菌種酒釀中甲醇含量的測定</p><p>　　制備甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取7支刻度一致的試管，分別加入各個菌種酒釀濾液，濾液量需含0.3mL乙醇（按乙醇濃度計算），加水至5mL，混勻。各管加入2mL高錳酸鉀-磷酸溶液，混勻，放置10min。各管加2mL草酸-硫酸溶液，混勻后靜置，使溶液褪色。各管再加入5mL品紅亞硫酸溶液，混勻，于20℃以上靜置

46、0.5h，于590nm波長處測吸光度[10]，平行測定3次。</p><p>　　甲醇含量(g/100mL)=m/(V×1000)×100</p><p>　　式中：m——測定樣品中所含的甲醇相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的毫克數(shù)，mg；</p><p>　　V——樣品取樣提取，mL。</p><p>　　2.5.2.3 不同菌種酒釀中糖度的

47、測定</p><p>　　米飯在糖化發(fā)酵過程中，大部分淀粉轉(zhuǎn)化成了糖。淀粉在淀粉酶等糖化酶的作用下轉(zhuǎn)化為糊精和葡萄糖等可發(fā)酵性糖，賦予發(fā)酵液一定的甜味和黏稠度[15] 所以可使用斐林試劑法測定酒釀中的糖度。具體方法如下：制備斐林試劑，取甲液5mL+乙液5mL置于250mL三角瓶中，加入10mL水，并從滴定管中加入0.2%的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖若干毫升（量控制在后滴定時消耗G在0.5-1.0mL）。電爐上加熱至沸，并保持微沸

48、2min，加2滴1%次甲基藍(lán)溶液，趁沸以每兩秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.2%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖滴定至藍(lán)色消失，有紅棕色沉淀，溶液清亮為終點止。記錄耗用的葡萄糖量為V0，必須在1min內(nèi)完成。同上法取斐林試劑，加10mL待測液，搖勻于電爐上加熱至沸，保持微沸2min，加2滴1%次甲基藍(lán)，用0.2%葡萄糖滴定至藍(lán)色消失。記錄耗用的葡萄糖量為V1。同上法吸取斐林試劑加10mL各個菌種酒釀濾液（預(yù)先稀釋50倍），補加（V0-V1）mL水，并

49、從滴定管中預(yù)先加入（V1-1）mL0.2%葡萄糖，搖勻至電爐上加熱至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基藍(lán)，繼續(xù)用葡萄糖滴定至藍(lán)色消失[11]。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖體</p><p>　　還原糖含量(以葡萄糖計)( g/mL) =(Vo-V) ×0.002×1/10×n式中：</p><p>　　Vo——斐林試劑標(biāo)定值，mL；</p><

50、;p>　　V——樣品糖液測定值，mL；</p><p>　　0.002——標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液濃度，g/mL；</p><p>　　10——樣品糖液體積，mL；</p><p>　　n——樣品稀釋倍數(shù)。</p><p>　　2.5.2.4 不同菌種酒釀中酸度的測定</p><p>　　根據(jù)發(fā)酵工藝原理，在還原糖發(fā)酵生成酒

51、精的同時，也生成甘油和有機酸。發(fā)酵過程的酸度即主要來源于此[15]。所以可用滴定法來測定酒釀中的酸度，具體方法如下：用移液管吸取各個菌種酒釀濾液10.00mL，移入100mL錐形瓶中，加入20mL蒸餾水稀釋，加酚酞指示劑1~2滴，用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點[12]。記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，平行測定3次。</p><p>　　總酸(以HAc計)(g/100mL) =(cV)NaOH×

52、;MHAc/20式中：</p><p>　　cNaOH——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；</p><p>　　VNaOH——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積，mL；</p><p>　　MHAc——HAc的分子質(zhì)量。</p><p>　　2.5.2.5 不同菌種酒釀中蛋白含量的測定</p><p>　　利用福林酚法[1

53、3]測定蛋白含量。制備酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取各個菌種酒釀濾液1.0mL測定蛋白含量，平行測定3次。</p><p>　　2.5.2.6 不同菌種酒糟中風(fēng)味物質(zhì)的測定</p><p>　　影響酒類風(fēng)味成分是多樣的，迄今為止，以確認(rèn)存在的化合物有醇、酯、羥基、含硫化合物，酒花成分、有機酸、氨和胺等，達(dá)到200種以上。這些物質(zhì)的適量存在，通常對酒類的風(fēng)味有益，而當(dāng)其含量過多

54、時，則往往會影響或損害酒類的風(fēng)味[16]。</p><p>　　樣品預(yù)處理（液液萃取）：將40 mL 蒸餾白酒酒置于200 mL 的燒杯中, 加入2.0 g NaCl 攪拌至溶解，再倒入250 mL 的分液漏斗中，加入10 mL 飽和食鹽水，然后用乙醚/正戊烷( 2∶1) 40 mL、30 mL、20 mL、20 mL 萃取，合并醚烷萃取液, 用50 mL 飽和食鹽水洗滌兩次, 再用50 mL 水洗滌兩次，有機相

55、用無水硫酸鈉干燥即可。利用氣相色譜-質(zhì)譜法測定酒糟中風(fēng)味物質(zhì)，操作條件：分離柱為 HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mmi·d×0.25um）；初始溫度為40℃，以10℃/min的速率升至 230℃，保持30min；高純氦氣（純度99.999%）為載氣，流速0.7mL/min；進(jìn)樣量0.2μL，分流比20∶1；接口溫度 280 ℃；全掃描數(shù)據(jù)采集，質(zhì)量范圍29~400 au；數(shù)據(jù)采集速率為4.44

56、Scans/Sec[14]。</p><p><b>　　3 結(jié)果分析</b></p><p>　　3.1 不同菌種對曲種質(zhì)量的影響</p><p>　　3.1.1 不同菌種對曲種蛋白酶活力的影響</p><p>　　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖1，回歸方程為：y=103.95x-0.2908，R2 = 0.99

57、97。由表3可知，各種菌株三代與五代比較，三代菌株酶活力較高；各種菌株母本3代、5代與融合菌株3代、5代比較，米曲霉母本的酶活力最高，根霉菌株次之，米5 B酶活力最差。通過表3的數(shù)據(jù)分析可知，親本三代與五代間、各融合3代與5代間蛋白酶活力并無顯著差異，母本與融合菌株之間的蛋白酶活力有極顯著差異。米根3A在融合菌株中呈現(xiàn)出最高的酶活力達(dá)到224.20比親本最高的米3的336.02U差112U，酶活力最差的為米跟5B僅為151.23U。 &

58、lt;/p><p>　　表3 不同菌種的蛋白酶活力結(jié)果</p><p>　　3.1.2 不同菌種對曲種糖化酶活力的影響</p><p>　　不同菌種對曲種糖化酶活力的影響見表4。</p><p>　　表4 不同菌種的糖化酶活力</p><p>　　各種菌株三代與五代比較，根3、米根3代A酶活力低于其五代酶活；米根3B高

59、于米根5B 酶活力，米3親本遠(yuǎn)高于米5親本；各種菌株母本3代、5代與融合菌株3代、5代比較，米3親本的糖化酶活力最高，融合菌株米根3A和米根5A次之，米5親本則最低。通過表4的數(shù)據(jù)分析可知，絕大部分的親本3代與5代間及融合菌株3代與5代間無顯著差異，只有三代米親本與五代米親本間體現(xiàn)出極顯著差異，親本與融合菌株間有顯著差異,其中米根5代A與米親本5代間有極顯著差異。融合菌株中米根5A呈現(xiàn)出最高的糖化酶活力達(dá)到314.97U/g與酶活力最高

60、的米3(350.61U/g)差35.64U/g。</p><p>　　3.2 不同菌種對酒釀物質(zhì)的影響</p><p>　　3.2.1 不同菌種對酒釀中乙醇含量的影響</p><p>　　酒精濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2，回歸方程為：y=40.123x-0.0647，R2 = 0.9967。</p><p>　　根據(jù)表6數(shù)據(jù)可知各種菌

61、株3代與5代比較，除了米根3A的乙醇含量要比米根5A要低，其他3代的乙醇含量都要比5代高。由表6可知，米根5A所發(fā)酵的酒釀的酒精濃度最高，甜酒曲、米3親本、根3親本、米根3A、根5親本間相差不大，而米根融合菌株B則最低。各種菌株3代與5代相比，除米根3B和米根5B之間無顯著差異之外，其他菌株3代與5代間皆存在顯著差異。通過表6的數(shù)據(jù)分析可知，米根融合菌株與母本及甜酒曲之間的酒精濃度有極顯著差異，米根融合菌株A,B之間也存在極顯著差異。其

62、中米根5A酒精度為15.37比根3親本（13.4）高1.97。</p><p>　　表6 不同酒釀產(chǎn)品的酒精濃度</p><p>　　3.2.2 不同菌種對酒釀中甲醇含量的影響</p><p>　　甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖3，回歸方程為：y=4.1958x-0.0469，R2 = 0.9938。</p><p>　　國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定酒

63、類（非葡萄酒）中甲醇濃度≤0.1g/100mL，按表7可知，所有酒釀的甲醇濃度均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。</p><p>　　各種菌株3代與5代相比，米3B比米5B的甲醇含量低，其他菌株酒釀3代都比5代要高。根據(jù)觀察表7的數(shù)據(jù)，米根B 3代與5代的甲醇含量最高，米根3A和根3次之，米5A甲醇含量最低。通過表7的數(shù)據(jù)分析可知，米3A與米5A之間存在顯著差異，其他菌株3代與5代之間均無顯著差異。米根A與親本間無顯著差異，米根B

64、與親本和米根A間存在極顯著差異。其中甲醇含量最低的是米根5A濃度為0.0054g/100mL比甜酒曲的0.0057g/100mL還要低0.0003g/100mL。</p><p>　　表7 不同酒釀產(chǎn)品的甲醇濃度</p><p>　　3.2.3 不同菌種對酒釀中糖度的影響</p><p>　　根據(jù)方案測得V0=24.8mL。由表8可知，各種菌株3代與5代相比較，親

65、本3代比5代糖度要高，融合菌株3代比5代的糖度要低，糖度以三代米親本所發(fā)酵的酒釀最高，甜酒曲和米根A其次，三代根親本和五代米親本最低。從表8數(shù)據(jù)分析可知除了根3與根5間無顯著差異，其他菌株3代與5代間都存在顯著差異，并且米3與米5間存在極顯著差異。融合菌株與親本間存在極顯著差異，融合菌株A和B之間存在顯著差異。糖度最高的融合菌株是米根5A糖度為0.167g/mL與米3（0.197g/mL）差0.03g/mL。</p>&l

66、t;p>　　表8 不同酒釀產(chǎn)品的糖度</p><p>　　3.2.4 不同菌種對酒釀中酸度的影響</p><p>　　不同酒釀產(chǎn)品的酸度見表9</p><p>　　表9 不同酒釀產(chǎn)品的酸度</p><p>　　由表9可知，各種菌株3代與5代相比較，3代的酸度均比5代的酸度高。酸度以米根3代B所發(fā)酵的酒釀最高，米根3代A和米根5代B次

67、之，3、5代米親本則最低。通過表9的數(shù)據(jù)分析可知，除米根3A與根3之間無顯著差異外，融合菌株與親本均有極顯著差異。融合菌株之間米根3A與米根3B存在顯著差異、米根5A與米根5B之間存在極顯著差異。融合菌株中米根5A的酸度最低只有1.14 g/100mL比親本酸度最低的米5（0.93 g/100mL）高0.21g/100mL。</p><p>　　3.2.5 不同菌種對酒釀中蛋白含量的影響</p>&

68、lt;p>　　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖4，回歸方程為：y=124.18x-2.3437，R2 = 0.9924。</p><p>　　由表10可知，各種菌株3代與5代相比較，3代的蛋白質(zhì)含量比5代高，蛋白含量以甜酒曲及米3親本所發(fā)酵的酒釀最高，根3親本、根5親本、米5親本、米根3A次之，米根5A和米根5B則最低。通過表10的數(shù)據(jù)分析可知，融合菌株米根5A、米根5B與親本間存在極顯著差異，米根3A

69、、米根5A與親本間無顯著差異，米根5B與其他3組融合菌株間存在顯著差異。融合菌株中蛋白含量最高的是米根3A達(dá)到113.17g/100mL比米3 143.13g/100mL差30g/100mL。</p><p>　　表10 不同酒釀產(chǎn)品的蛋白含量</p><p>　　3.2.6 不同菌種對酒糟中風(fēng)味物質(zhì)的影響</p><p>　　由氣相色譜—質(zhì)譜法測定酒糟中風(fēng)味物質(zhì)

70、，根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取甜酒曲與米曲霉+根霉進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的比較。酒糟中部分風(fēng)味物質(zhì)相對含量比較如表11。由表可知，對二甲基苯、1，2，4三甲基苯、1 -乙基-3-甲基苯為各菌株共有的雜環(huán)化合物，這三種化合物在米3中含量較低。酯類風(fēng)味物質(zhì)在甜酒曲中含量高且類型多樣，如2，4二甲基-（2，4 -二甲基苯基）苯甲酸甲基酯、棕櫚酸乙酯。融合菌株和米3含有α膽甾醇，并且含量較高，甜酒曲和根3中的醇類物質(zhì)較少。兩種特征性物質(zhì)α膽甾醇和1 -乙基-3

71、-甲基苯見圖5、圖6。米根5A的質(zhì)譜儀分析圖見圖7。</p><p>　　圖5 α膽甾醇 圖6 1 -乙基-3-甲基苯</p><p>　　表11 酒糟中風(fēng)味物質(zhì)相對含量比較</p><p>　　米根5A的質(zhì)譜儀波峰圖如下：</p><p>　　圖5 米根5A質(zhì)譜儀波峰圖</p&

72、gt;<p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本次實驗主要研究米曲霉、根霉原生質(zhì)一次基因組改組融合后代及其雙親的發(fā)酵酒釀特性。在用米飯做為培養(yǎng)基制曲后，所有菌株所制曲種的酶活力，都是以母本的最高。在蛋白酶活力上各菌株三代的普遍高于其五代，在糖化酶活力上除了根3和米根3代A酶活力低于其五代酶活力外其他均表現(xiàn)出3代高于5代。在酶活力上親本與融合菌株間有顯著差異，各

73、菌株3代與5代間無顯著差異。融合菌株制成的曲種在糖化酶活力的穩(wěn)定性比米曲霉曲種高，這可能是由于經(jīng)過原生質(zhì)體融合之后，根霉在糖化酶活力上的穩(wěn)定性很好的保存了下來，并在米根融合菌中體現(xiàn)。</p><p>　　在融合菌種所制曲種酶活力上，米根3A在融合菌株中呈現(xiàn)出最高的蛋白酶活力達(dá)到224.20u，米根5A呈現(xiàn)出最高的糖化酶活力達(dá)到314.97U/g。</p><p>　　各融合菌株菌株經(jīng)發(fā)酵后

74、，米根5A發(fā)酵效果最好，酒精濃度是15.37%，糖度為0.167g/mL，酸度為1.14 g/100mL，蛋白含量為103.62μg/mL。經(jīng)過質(zhì)譜儀分析風(fēng)味物質(zhì)含量后發(fā)現(xiàn)，米根5A含有的α膽甾醇含量較高達(dá)到60.50%，這導(dǎo)致了米根5A的酒精濃度比其他菌株發(fā)酵后的酒精濃度高。而根據(jù)觀察風(fēng)味物質(zhì)可以發(fā)現(xiàn)，融合菌株含有的膽甾醇苯甲酸酯含量不高并且也沒有其他含量較高的酯類，所以它的蛋白含量偏低。而在后代菌株發(fā)酵的穩(wěn)定性上來看，融合菌株的穩(wěn)定

75、性同樣比米曲的發(fā)酵穩(wěn)定性好。融合菌株中米根5B的發(fā)酵產(chǎn)品最差，蛋白含量低，酒精濃度低，酸度高，甲醇含量高。所有菌種的發(fā)酵產(chǎn)品的甲醇含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。通過氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定酒糟中風(fēng)味物質(zhì)，可得出非常多的香味物質(zhì)，融合菌株中以雜環(huán)化合物與醇類含量最多，酯類次之，醛類最少。而甜酒曲則以雜環(huán)化合物和酯類含量為主，酸類次之。</p><p>　　實驗結(jié)果為：融合菌株在醇類的含量上高于親本，使其酒精濃度得到顯著提高，而酯

76、類含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如甜酒曲及親本中的酯類含量豐富，導(dǎo)致其蛋白含量偏低。但在糖度和酸度上，融合菌株明顯要比單親本發(fā)酵的效果好。在后代的穩(wěn)定性上，米曲酶的穩(wěn)定性不好，融合菌株和根霉的穩(wěn)定性較好，并且融合菌株米根5A體現(xiàn)出比其3代有更高的酒精濃度、糖度及較低的酸度優(yōu)勢，雖在蛋白含量上下降，但根據(jù)工藝改進(jìn)或者菌株的再優(yōu)化可以解決存在的問題。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p&g

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