鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究.pdf

1、鏈格孢是半知菌暗色絲孢菌中重要的一類真菌，該屬真菌種類多，寄主范圍和地理分布廣泛。95％以上的種能兼性寄生在植物上，是重要的植物病原菌。有些種是人和動物的條件致病菌，引起多種疾病。有些種可用作殺菌劑、除草劑等，是有應(yīng)用潛力的生物資源。因此鏈格孢的正確分類鑒定具有重要的理論和實踐意義。 然而由于該屬真菌受環(huán)境條件或培養(yǎng)條件的影響，分生孢子的形態(tài)變異幅度較大，僅依靠表形特征為依據(jù)的傳統(tǒng)分類方法已不能滿足需要，必須探索其它分類方法來彌

2、補(bǔ)傳統(tǒng)分類的不足。許多研究者從很多方面研究了鏈格孢的種級分類標(biāo)準(zhǔn)，但是目前在多種分類方法所得到的結(jié)論，及這些方法在鏈格孢種級分類中的作用等方面存在一些爭議和混亂，這些現(xiàn)象給鏈格孢的發(fā)展和交流，及應(yīng)用研究帶來了很大影響。本研究的目的就是從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)等方面探索一套簡便易行的分類方法，以解決目前鏈格孢分類上存在的一些問題。 首先從全國20多個省、自治區(qū)、直轄市實地采集近2000份標(biāo)本，加本實驗室、標(biāo)本

3、室保存的標(biāo)本共計5000余份，經(jīng)保濕培養(yǎng)，獲得近250個菌株。以分生孢子形態(tài)及產(chǎn)孢表型特征為主要分類依據(jù)，共描述鑒定鏈格孢44種，其中，新種7個，新組合1個，中國新記錄種5個(見附錄)，補(bǔ)充描述中國已報道種29個，不確定種2個。 蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，蛋白圖譜所表現(xiàn)的構(gòu)形、凈電荷及分子量的不同反映了物種之間的不同。為了從蛋白質(zhì)水平檢測鏈格孢種間的差異，我們在審慎的形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，選用15個菌株進(jìn)行可溶性蛋白凝膠電泳分析，

4、21個菌株進(jìn)行酯酶同工酶分析。結(jié)果顯示，不同種間可溶性蛋白圖譜的帶型具多型性，種內(nèi)菌株間的帶型具相似性。不同種間的酯酶同工酶帶型具多型性，種內(nèi)菌株間帶形基本一致。聚類分析都得到了和形態(tài)鑒定一致的結(jié)果。 表形性狀的差異最終是由基因型決定的。RAPD技術(shù)用隨機(jī)引物對整個基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，具有極大的豐富性和探測性。我們用篩選出的9個隨機(jī)引物對57個鏈格孢菌的基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，共得到142個多態(tài)性帶，平均每個引物15.8

5、條帶。聚類結(jié)果顯示，大孢子種和小孢子種能明確區(qū)分成兩組，小孢子種在42％的相似系數(shù)處，可分為6組，其中A.infectoria和A.brassicicola，是非常明確可區(qū)分的種，其它四組與形態(tài)鑒定結(jié)果基本一致，但存在個別種交叉重疊現(xiàn)象。對核苷酸測序，可直觀得到基因上的差異。用通用引物ITS1和ITS4對23個菌株的rDNAITS1-5.8S-ITS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有菌株都獲得了長約570bp的特異性條帶。將獲得的序列資料分別用DN

6、AMAN軟件和NCBI的BLAST2SEQUENCES數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示用這兩種方法得到的小孢子種間的同源性都高達(dá)99％，說明鏈格孢小孢子種不能依據(jù)ITS區(qū)進(jìn)行區(qū)分。 為了評價鏈格孢菌的致病性差異，用80個鏈格孢菌株的菌圓片接種刺傷的鴨梨果實和葉片，結(jié)果顯示測試菌株產(chǎn)生的病斑癥狀和大小沒有明顯區(qū)別，用不同濃度的孢子懸浮液接種葉片，結(jié)果所有的菌株都能致病，而且濃度越高產(chǎn)生的病斑越明顯，但是每個菌株的侵染數(shù)限不同。

7、 本論文除了以表形特征為依據(jù)鑒定描述了若干新種、新組合、及中國新記錄種外，還對多個已發(fā)表種和新種的系統(tǒng)演化關(guān)系作了較深入全面的分析，探索總結(jié)出一套適用于鏈格孢種級分類的綜合的分類指標(biāo)，并對數(shù)十個已發(fā)表種一致人工培養(yǎng)條件下的特征作了充分的補(bǔ)充描述，加深了人們對它們的認(rèn)識。主要觀點如下： 在目前的技術(shù)條件下，鏈格孢菌的分類鑒定仍然以形態(tài)特征為主要鑒別依據(jù)，是其它分類手段的基礎(chǔ)。菌體可溶性蛋白和酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)操作簡便

8、，費用少，譜帶穩(wěn)定直觀，較綜合地反映了基因組中核苷酸的組成和序列的變化，是進(jìn)行鏈格孢分類的非常有價值的生化指標(biāo)，可以驗證和補(bǔ)充形態(tài)鑒定結(jié)果，并可以在疑難種的鑒定和判定新種時發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然RAPD本身存在一些缺點，使其在種級分類的應(yīng)用上有一定的局限性，但RAPD技術(shù)使用隨機(jī)引物對整個基因組DNA的多個位點進(jìn)行擴(kuò)增，帶型反映了DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征，在嚴(yán)格控制實驗條件的情況下，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類的一些不足，在一定程度上可以驗證某些種