畢業(yè)論文the construction of fas iii prokaryotic expression vectors

1、<p>　　The construction of fas III prokaryotic expression vectors </p><p>　　Abstract: Drosophila Fas gene is protein coding gene in testis, mainly expressed in hub cell. In this experiment, by means of g

2、ene cloning technique, the target gene FasIII was inserted into the plasmid vector PET28a which was digested by two enzymes of BamHI and HindⅢ. so as to construct the prokaryotic expression vector PET28a-fasⅢ, then the r

3、ecombinant plasmid was transformed into Escherichia coli TOP10, achieve Fas III gene prokaryotic expression. The plasmid vector was marked with kanamycin</p><p>　　Key words: Gene cloning；fasⅢ；the prokaryotic

4、 expression vector；</p><p>　　prokaryotic expression；</p><p>　　果蠅精巢fasⅢ基因原核表達載體的構建</p><p>　　摘 要：果蠅fasⅢ基因是蛋白編碼類基因，在精巢中fasⅢ基因主要在hub cell中表達，本實驗運用基因克隆技術，以PET28a質粒為載體，選用BamHI、HindⅢ兩種酶做雙

5、酶切，將目的基因fasⅢ導入質粒載體PET28a，從而構建原核表達載體PET28a-fasⅢ，再將重組質粒轉化到大腸桿菌TOP10中，實現(xiàn)fasⅢ基因的原核表達。實驗所用質粒載體用卡那抗性（Kanr ）標記，只有轉化成功的大腸桿菌才能在涂有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長。最終目的是實現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎。</p><p>　　關鍵詞：基因克隆；fasⅢ基因；原核表達載體；原核表

6、達；</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘 要錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1前言錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.1 果蠅精巢的基本特征錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.2 fasⅢ基因錯誤!未定義書簽。</p>

7、<p>　　1.3載體 錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.4 抗菌素的抗性工作原理錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2 實驗材料與方法錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1實驗材料錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.1 實驗儀器錯誤!未定義書簽。</p><p>

8、　　2.1.2實驗試劑錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.3引物錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1.4質粒載體錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2實驗方法錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.1目的基因的獲取錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.2 酶切

9、錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.4 DNA片段的體外連接(目的基因導入質粒載體)錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.5連接體系的轉化錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.6挑菌落做菌落PCR錯誤!未定義書簽。</p&

10、gt;<p>　　2.2.7重組質粒的轉管培養(yǎng)錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.8 PET28a-fasⅢ質粒的少量制備錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2.9重組質粒雙酶切鑒定錯誤!未定義書簽。</p><p>　　三、實驗結果與分析錯誤!未定義書簽。</p><p>　　3.1目的基因PCR

11、錯誤!未定義書簽。</p><p>　　3.2質粒和目的基因片段酶切反應錯誤!未定義書簽。</p><p>　　3.3 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA 錯誤!未定義書簽。</p><p>　　3.4 菌落PCR鑒定錯誤!未定義書簽。</p><p>　　3.5 質粒制備的鑒定錯誤!未定義書簽。</p><p

12、>　　3.6 重組質粒雙酶切鑒定錯誤!未定義書簽。</p><p>　　四、討論錯誤!未定義書簽。</p><p>　　參考文獻錯誤!未定義書簽。</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　1.1 果蠅精巢的基本特征&

13、lt;/p><p>　　有兩個精巢，形狀為長而卷曲狀的管狀，圖示1-2 [3]顯示出了精巢前端的結構。精巢里有兩類干細胞:生殖干細胞GSC和體節(jié)干細胞SSC。GSC有7-9個，位于精巢的頂端，與Hub cell（HC）直接接觸，HC是精巢GSC微環(huán)境的重要組成部分 [4]，SSC包裹在GSC周圍，和HC共同構成了GSC的“niche” [5]。同卵巢GSCs一樣 ,精巢的GSCs也通過不對稱分裂產生2個子代細胞，一個

14、仍然處于微環(huán)境中，與HC直接接觸，成為新的GSC，另一個遠離微環(huán)境，發(fā)育為GB（gonialblast）細胞，走向分化。GB細胞經四次胞質不完全分裂形成一個16cell相連的合胞體。Fusome在GB中是圓形的，在分化的合胞體呈分支狀。每個GB或合胞體都被兩個SCCs圍繞著，持續(xù)調控它們的分化。</p><p>　　圖1-2 精巢前端的結構</p><p>　　Fig.1-2 The le

15、ading-end structure of tesis</p><p>　　1.2 fasⅢ基因</p><p>　　干細胞研究是目前國際研究前沿的熱點之一，生殖干細胞GSC的研究對于干細胞維持與分化等領域，以及生殖醫(yī)學及其相關疾病等的治療都將提供有價值的資料。果蠅具有繁殖周期短、結構相對簡單、擁有成熟的遺傳分析手段及豐富的遺傳學資源等特點；同時鑒于果蠅生殖干細胞分裂和分化發(fā)育過程中的細

16、胞譜系都研究得很清楚，故果蠅的精巢和卵巢是細胞和分子水平上研究干細胞生物學的理想系統(tǒng)。</p><p>　　fasⅢ基因是蛋白編碼類基因，具有七個轉錄本，最早發(fā)現(xiàn)于神經細胞中，功能是以Ca2 +獨立的方式介導細胞粘附，在軸突發(fā)展、指導和束狀的神經系統(tǒng)的發(fā)展發(fā)揮作用。 </p><p>　　果蠅精巢中fasⅢ基因主要在hub cell中表達 [1]，利用fasIII基因的表達蛋白制備多克隆抗

17、體，進行抗原抗體免疫熒光反應，可以確定Hub細胞的位置[2]，從而有利于對果蠅精巢干細胞的研究。</p><p>　　1.3 載體 （Vectors）</p><p>　　廣義上通常把能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具叫載體。在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體 [6]。</p><p>　　1、基因工程對載體的要求：</p&g

18、t;<p>　?。?）具有對受體細胞的可轉移性，可提高載體導入受體細胞的效率。</p><p>　?。?）具有與特定受體細胞相適應的復制原點或整合位點，使得外源基因可在受體細胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。</p><p>　　（3）具有多種單一的核酸酶切位點(多克隆位點)，可用于外源基因的插入，同時不影響載體的擴增和繁殖。</p><p>　?。?）具有合適

19、的選擇標記，便于重組DNA分子的檢測。</p><p>　?。?）具有較好的安全性，不能任意轉移，避免基因的非控制性擴散，給人類造成危害。</p><p>　　本實驗選用的PET28a為質粒載體，長度為5369bp 。</p><p>　　1.4 抗菌素的抗性工作原理</p><p>　　卡那霉素（kanamycin，Kan）殺菌原理：<

20、;/p><p>　　通過與70S核糖體結合，導致mRNA發(fā)生錯讀。殺死細菌。</p><p>　　細菌抗性原理：Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結合作用。</p><p><b>　　2 實驗材料與方法</b></p><p><b>　　2.1實驗材料</b>&l

21、t;/p><p>　　2.1.1 實驗儀器</p><p>　　表2.1 實驗儀器及廠家</p><p>　　Table 2.1 Experimental instruments and manufacturers</p><p><b>　　2.1.2實驗試劑</b></p><p>　　限制性核酸

22、內切酶：BamHI HindⅢ</p><p>　　10×K Buffer通用Buffer</p><p><b>　　BSA</b></p><p>　　primerSTAR MAX premix</p><p><b>　　cDNA模板</b></p><p&g

23、t;<b>　　CIAP堿性磷酸酶</b></p><p><b>　　瓊脂糖</b></p><p><b>　　1×TAE緩沖液</b></p><p><b>　　溴化乙錠溶液EB</b></p><p>　　DNA分子量Marker15k

24、b</p><p>　　10×loading buffer</p><p><b>　　5M Nacl</b></p><p><b>　　苯酚、氯仿</b></p><p><b>　　無水乙醇</b></p><p><b>　　

25、75%乙醇溶液</b></p><p><b>　　T4 DNA連接酶</b></p><p>　　10×T4 DNA ligase buffer</p><p>　　Inoue 轉化緩沖液</p><p><b>　　DMSO二甲亞礬</b></p><p

26、><b>　　LB液體培養(yǎng)基</b></p><p>　　試劑盒：瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒離心柱型</p><p>　　質粒小提試劑盒（離心柱型）</p><p><b>　　2.1.3引物</b></p><p>　　本實驗所用的擴增引物和測序序列均由生工生物工程上海有限公司合成部合成。&

27、lt;/p><p>　　引物片段：Fas-bamH/F： ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCG</p><p>　　Fas-Hind/R： ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG</p><p><b>　　2.1.4質粒載體</b></p><p>　　本實驗所用質粒載體P

28、ET28a來自于本實驗室保存。</p><p><b>　　2.2實驗方法</b></p><p>　　2.2.1目的基因的獲取</p><p><b>　　1、PCR反應體系</b></p><p>　　表2.1 PCR反應體系 150μl</p><p>　　Ta

29、ble 2.1 PCR reaction system(150μl)</p><p><b>　　2、PCR反應程序</b></p><p>　　98℃ 5min</p><p>　　98℃ 20s</p><p>　　30 cycles 55℃ 20s</p><

30、;p>　　72℃ 1min30s</p><p>　　72℃ 5min</p><p>　　16℃ 4min</p><p>　　3、瓊脂糖凝膠電泳檢測</p><p>　　（1）制備0.1％瓊脂糖凝膠：稱取0.25g瓊脂糖，加入25ml1×TAE緩沖液，置微波爐加熱至完全融化，取出搖勻。</p&

31、gt;<p><b>　?。?）膠板的制備：</b></p><p>　　將塑料內槽洗凈、晾干，放置于水平制膠器中，并放好樣品梳；</p><p>　　待膠液冷到60℃左右時，加入2—3μl的溴化乙錠，輕輕混勻后將膠液倒入塑料內槽，至塑料板上形成一層膠面；</p><p>　　待膠液凝固后，將梳子輕輕垂直拔出；</p>

32、<p>　　將塑料內槽取出放入電泳槽內，并加入1×TAE緩沖液至電泳槽中使緩沖液浸沒膠面，高出凝膠。</p><p>　　（3）加樣：取約2μl10×loading buffer與2μl PCR產物混合均勻，用移液槍加到凝膠孔中，并用DL15000TM DNA Maker 做對照。</p><p>　?。?）電泳：蓋好電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，

33、選擇電泳電壓120V，開始電泳。</p><p>　?。?）觀察結果：取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像，根據(jù)片段大小判斷目的片段是否擴增成功。</p><p><b>　　2.2.2 酶切</b></p><p>　　1、DNA產物的純化</p><p>　　產物共150μL，集中到1.5mL EP管，加無菌水至500μL

34、</p><p>　?。?）酚抽：在EP管中加入等體積，即500μL苯酚/氯仿混合液，顛倒混勻，室溫12000r/min離心5min，吸取上層液到新的EP管，吸約450μL</p><p>　　（2）加入1/10體積的5M NaCl（按450uL換算，即45μL NaCl）</p><p>　?。?）加入2-3倍體積無水乙醇1mL，混勻，4℃12000r/min離心

35、10min，吸走上清液，產物沉淀在底部。</p><p>　?。?）漂洗：用70%乙醇清洗沉淀1-2次，離心，徹底吸走上清液。</p><p>　?。?）干燥和溶解：自然干燥5min至殘留乙醇揮發(fā)干凈，加入20μL無菌水溶解。</p><p>　　2、酶切，體系如表2.2所示</p><p>　　表2.2 酶切體系 50μl</p

36、><p>　　Table 2.2 Enzyme digestion system(50μl)</p><p>　　溶液配好混勻后瞬時離心，使溶液集中于管底，放在37℃ 水浴鍋水浴1h；其中PET28a質粒酶切管在水浴1h后需加入1μlCIAP，接著水浴30min。</p><p>　　2.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA</p><p><

37、;b>　　制膠</b></p><p><b>　　切膠</b></p><p>　　瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒</p><p><b>　　操作步驟</b></p><p>　?。?）柱平衡步驟：向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中

38、的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　?。?）將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱取重量。</p><p>　?。?）向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50℃水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。</p><p>　?。?）將上一步所得的溶液加入一個吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000

39、rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　?。?）將吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　?。?）重復操作步驟5</p><p>　　（7）將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸

40、附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。</p><p>　　（8）將吸附柱CA2放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min。12000rpm離心2min收集DNA溶液。</p><p>　?。?）電泳檢測：分別取3μl酶切樣品與2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像

41、。</p><p>　　2.2.4 DNA片段的體外連接(目的基因導入質粒載體)</p><p>　　1、配制連接體系，各成分如表2.3所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些；</p><p>　　表2.3 連接體系 10μl</p><p>　　Table 2.2 Connection system(10μl)</p&

42、gt;<p>　　2、混勻后用瞬時離心，使液體全部集中于管底；</p><p>　　3、將離心管放于16℃ 水浴鍋保溫過夜；</p><p>　　4、取出連接體系，利用感受態(tài)細胞進行轉化實驗。</p><p>　　2.2.5連接體系的轉化</p><p>　　取1管100μl的TOP10超級感受態(tài)細胞，在冰上化凍后，在無菌操作臺

43、里向EP管中加入7μl連接體系，用槍輕輕吹打混勻；</p><p>　　將EP管插在冰水復合物中冰浴30min；</p><p>　　將EP管放到42℃恒溫水浴鍋中保溫90s，然后迅速放到冰水復合物中冰浴2min；</p><p>　　在無菌操作臺里向EP管中加入1ml的含K的液體LB培養(yǎng)液，混勻后放于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)45min，轉速為150rpm/min，使細

44、胞恢復正常生長狀態(tài)；</p><p>　　45min之后，3000r/min離心3min</p><p>　　在無菌操作臺中棄去950μl上清液，余下的150μl用移液槍輕輕打勻，吸至含K的LB培養(yǎng)基平板中，用事先已經加熱滅菌并冷卻后的三角推棒輕輕涂布均勻；</p><p>　　待涂布液干燥后，將平板37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。</p><p&g

45、t;　　2.2.6挑菌落做菌落PCR</p><p><b>　　1、PCR反應體系</b></p><p>　　表2.4 PCR反應體系 25μl</p><p>　　Table 2.4 PCR reaction system(25μl)</p><p>　　模板：陽性對照—重組質粒的連接體系</p>

46、<p><b>　　陰性對照—無菌水</b></p><p>　　實驗組—待檢測的菌落</p><p><b>　　PCR反應程序</b></p><p>　　97℃ 3min</p><p>　　94℃ 30s</p><p>　　30 cyc

47、les 52℃ 30s</p><p>　　72℃ 1min</p><p>　　72℃ 3min</p><p>　　16℃ 3min</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測：以DNA Mamker和陽性對照作參考，判斷實驗組條帶大小是否正確，進而判斷是否為陽性克隆。</p><

48、p>　　2.2.7重組質粒的轉管培養(yǎng)</p><p>　　經過菌落PCR鑒定后，挑選4個初步鑒定是陽性克隆的菌落轉管培養(yǎng)。</p><p>　　將無菌操作臺滅菌后，取4個15mlEP管，分別加入約4ml含卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基。</p><p>　　用無菌槍頭挑取單菌落，在EP管的培養(yǎng)基中輕輕攪拌，并將槍頭打入EP管中，蓋緊管蓋，放于搖床上37℃振

49、蕩培養(yǎng)過夜，轉速為180rpm/min。</p><p>　　2.2.8 PET28a-fasⅢ質粒的少量制備</p><p>　　菌液保種：將選取的菌液擴大培養(yǎng)，渾濁后分別取450μl菌液并各加入50μlDMSO于-20℃凍存。</p><p>　　用質粒小提試劑盒（離心柱型）提取并制備質粒。</p><p><b>　　操作步驟

50、：</b></p><p>　　柱平衡步驟：向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　　取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。</p><p>　　向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1（使用前已加入RNaseA）

51、,用移液槍徹底懸浮細菌沉淀。</p><p>　　向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解，所用時間不超過5分鐘。</p><p>　　向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。</p><p>　　將上一步收集的上清液用移液槍轉移到吸附柱CP3中，盡量不

52、要吸出沉淀。12000rpm離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。</p><p>　　向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。</p><p>　　向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中。<

53、;/p><p><b>　　重復操作步驟（8）</b></p><p>　　將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心1min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。</p><p>　　將吸附柱CP3置于一個感覺離心管中，向吸附膜中間部位滴加70μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質粒溶液收集到離心管中。</p&

54、gt;<p>　　離心管中收集制備好的質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測：分別取3μl提取的質粒DNA 樣品與2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像，根據(jù)片段大小判斷質粒是否制備成功。</p><p>　　2.2.9重組質粒雙酶切鑒定</p><p>　　1、酶切體系如表2.5所示</p>

55、<p>　　表2.5 酶切體系 30μl</p><p>　　Table 2.5 Enzyme digestion system(30μl)</p><p>　　溶液配好混勻后瞬時離心，使溶液集中于管底，放在37℃ 水浴鍋水浴1.5h；</p><p>　　2、瓊脂糖凝膠電泳檢測：</p><p>　　將所有雙酶切產物與

56、2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像。以15 kb DNA Mamker作參考，判斷實驗組條帶大小是否正確。</p><p><b>　　三、實驗結果與分析</b></p><p>　　3.1目的基因PCR</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖

57、3-1所示，本實驗所用DNA Marker為15000bp，DNA Marker：250-1000-5000-7500-10000-15000。目的基因fasⅢ為950bp,與Marker第二條帶（1000bp）基本對應。說明PCR產物為目的基因fasⅢ片段。</p><p>　　圖3-1 目的基因fasⅢ的PCR鑒定</p><p>　　Fig.3-1 Identification of

58、 PCR gene Fas III</p><p>　　1，2；目的基因片段M,DNA Marker；</p><p>　　3.2質粒和目的基因片段酶切反應</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖3-2所示，實驗所用DNA Marker為15000bp，目的基因fasⅢ為950bp，與Marker第二條帶（1000bp）基本對應。質粒PET28a為5

59、369bp,位于Marker第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。 </p><p>　　圖3-2 目的基因片段與質粒酶切反應后鑒定</p><p>　　Fig.3-2 The identification of target gene fragment and the plasmid </p><p>　　1，目的基

60、因fasⅢ的酶切結果；M，DNA Marker；2，質粒PET28a酶切結果；</p><p>　　3.3 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA </p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖3-3所示，實驗所用DNA Marker為15000bp，目的基因fasⅢ為950bp，與Marker第二條帶（1000bp）基本對應。質粒PET28a為5369bp,位于Marke

61、r第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。目的條帶清晰明亮，回收效果較好。</p><p>　　圖3-3 DNA回收后鑒定</p><p>　　Fig.3-3 The identification of DNA recovery </p><p>　　1，質粒PET28a；2，目的基因fasⅢ；M，DNA Marker；</p><

62、;p>　　3.4 菌落PCR鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測：以DNA Mamker(15000bp)和陽性對照作參考，其中,4是陽性對照，M是DNA Mamker，1，2，3，5，為菌落PCR產物，條帶清晰明亮，與陽性對照的條帶大小一致，說明是陽性克隆。</p><p>　　圖3-4菌落PCR的鑒定</p><p>　　Fig.3-4 The i

63、dentification of colony PCR</p><p>　　1，2，3，5，菌落PCR產物；4，陽性對照；M，DNA Marker；</p><p>　　3.5 質粒制備的鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖3-5所示，制備目的基因fasⅢ與PET28a的重組質粒，片段大小約6000bp，以DNA Mamker(15000bp

64、)作參考，位于Marker第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。其中1,2,3,分別對應EP管上編號為3,4,10。</p><p>　　圖3-5 質粒制備的鑒定</p><p>　　Fig.3-5 The Identification of plasmid</p><p>　　M，DNA Marker；1,2,3,重組質粒；</p>

65、<p>　　3.6 重組質粒雙酶切鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖3-6所示，雙酶切后的產物為兩條帶，分別是目的基因fasⅢ片段與質粒PET28a片段，其中目的基因片段與DNA Marker(15000bp)第一條帶對應，質粒PET28a片段與DNA Marker第四條帶對應，</p><p>　　1，2，3，分別對應EP管上編號為3，4，10

66、 </p><p>　　圖3-6 重組質粒雙酶切鑒定</p><p>　　Fig.3-６The recombinant plasmid was identified by double enzyme digestion</p><p>　　1，2，3，雙酶切產物；M，DNA Marker；</p>&

67、lt;p><b>　　四、討論</b></p><p>　　實驗成功構建了果蠅精巢fasⅢ基因原核表達載體，最終目的是實現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎。后續(xù)實驗還需將重組載體導入表達菌株BL21，實現(xiàn)fasⅢ基因的高效表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠層析法純化標記蛋白。利用fasⅢ表達蛋白制備多克隆抗體，可用于抗原抗體免疫熒光反應，從而標記hub cell的位置，

68、更利于了解和研究果蠅精巢結構。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] Peter M. Snow, Allan J. Bieber,and Corey S. Goodman Fasciclin III: A Novel Homophilic Adhesion Molecule in Drosophila. Cel[J], 1989

69、: 313-323.</p><p>　　[2] Eihachiro Kawase1, Marco D. Wong1, Bee C. Ding1 and Ting Xie, Gbb/Bmp signaling is essential for maintaining germline stem cells and for repressing bam transcription in the Drosophila

70、 testis. The Company of Biologists [J], 2004,131(59): 1365-1375.</p><p>　　[3]Kawase,E.et al.Gbb/bmp signaling is essential for maintaining germline stem cells and for repressing bam transcription in the Dros

71、ophila testis.Development [J], 2004.131(6):1365-1375.</p><p>　　[4] Yamashita,Y. M.,M.T.Fuller,and D.L.Jones.Signaling in stem cell niches:lessons from the Drosophila germline. Journal of cell Science[J], 200

72、5.118(4):665-672.</p><p>　　[5]Decotto, E. and A.C.Spradling.The Drosophila ovarian and testis stem cell niches:similar somatic stem cell and signals.Developmental cell[J], 2005.9(4):501-510.</p><p

73、>　　[6]劉祥林，聶劉旺.基因工程[B].科學出版社，2005：59-98.</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　時光荏苒，歲月如梭。轉眼間美好的大學四年生活已經接近了尾聲，經過四年的學習我在各個方面都有所提高。生命不止，奮斗不息。大學生活的結束，意味著我要踏上新的征程，再次揚帆起航。</p><p>　　經過

74、多天的努力，逐漸完成了本科畢業(yè)論文的實驗操作部分和寫作部分。這次的經歷讓我受益匪淺，同時也暴露出我在多方面的不足與缺陷。從開始不熟練的實驗操作到最后的獨立完成，從開始寫論文時的無從下手到最后的游刃有余，這一點一滴的進步都是在和同學的互幫互助以及老師的耐心指導下取得的。</p><p>　　在論文實驗設計和寫作過程中，我得到了陳XX老師極大地幫助和耐心的指導。從課題的選擇、實驗操作到項目的最終完成，陳老師始終耐心在

75、一旁給于指導，在實驗的過程之中，耐心的幫我解決遇到的問題，每個步驟都力爭做到最好。在論文初稿到成稿的過程之中，不厭其煩的為我修改。陳老師嚴肅的科學態(tài)度，嚴謹?shù)闹螌W精神，精益求精的工作作風，深深地感染和激勵著我并將積極影響我今后的學習和工作。陳老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時在我考研期間也給了我很多寶貴的意見。在此謹向陳老師致以崇高的敬意和誠摯的謝意，愿您一生幸福，安康！</p><p>　

76、　感謝實驗室所有成員：師姐朱XX、王X，師兄王X；同窗潘XX，曹XX，李XX。感謝你們的陪伴與幫助，尤其感謝師姐師兄對我的耐心指導和悉心解說，給予我很大的幫助，讓我受益匪淺，在這里請接受我誠摯的謝意。</p><p>　　最后，我要感謝我的母?！不諑煼洞髮W和生命科學學院在這四年</p><p>　　來對我的精心栽培。還有我的爸爸媽媽，姑姑、舅舅對我生活方方面面的關心，你們是我堅強的后盾