三草安前湯對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠il-1β、il-6及tnf rⅱ表達的影響

1、<p>　　三草安前湯對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠IL-1β、IL-6及TNF RⅡ表達的影響</p><p>　　作者：周青,熊偉,張國民,方圓,肖紅玉,龔秀英</p><p>　　【摘要】 目的 觀察三草安前湯對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子受體Ⅱ(TNF RⅡ)基因和蛋白表達的影響,闡明中藥復(fù)

2、方治療慢性非細菌性前列腺炎的炎癥因子蛋白靶點。方法 將72只健康雄性Wistar大鼠隨機分為6組,每組12只,除正常組外,其余5組應(yīng)用大鼠前列腺蛋白提純液輔以免疫佐劑制備實驗性慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型,正常組、模型組予生理鹽水,西藥組予消炎痛,三草安前湯大、中、小劑量組分別予不同劑量的三草安前湯連續(xù)灌胃。30 d后處死,采用免疫組織化學(xué)、熒光定量RT-PCR等方法檢測炎癥因子 mRNA及蛋白表達。結(jié)果 三草安前湯可顯著降低慢性非細菌

3、性前列腺炎模型大鼠炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表達水平(P＜0.01),且大、中劑量組作用優(yōu)于小劑量組(P＜0.05),大、中劑量組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；三草安前湯各劑量組TNF RⅡ表達降低,未隨劑量增加出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論 三草安前湯對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠異常的免疫功能有調(diào)節(jié)作用,降低炎癥因子表達</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 三草安前湯；慢性

4、非細菌性前列腺炎；炎癥因子；動物模型</p><p>　　Abstract： Objective To observe the effects of Sancaoanqian decoction on expression of cytokine IL-1β, IL-6 and TNF RⅡ in experimental autoimmune prostatitis rats, and explore the

5、 target protein of cytokine of Chinese herbal compound in treating chronic nonbacterial prostatitis. Methods Seventy-two male Wistar rats were divided randomly into six groups and 12 rats in each group. All groups were m

6、ade experimental autoimmune prostatitis rat model by injecting SC purified prostate protein with FCA </p><p>　　Key words：Sancaoanqian decoction；chronic autoimmune prostatitis；cytokine；animal model</p>

7、<p>　　慢性非細菌性前列腺炎(CAP)是男科臨床常見的難治性疾病之一,炎癥因子在CAP的發(fā)病過程中與炎癥的過程、轉(zhuǎn)歸相關(guān)。前期臨床觀察顯示,三草安前湯治療濕熱挾瘀型CAP取得滿意的臨床療效[1]。為進一步探討其作用機制,筆者從基因、蛋白水平考察了三草安前湯對CAP模型大鼠炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子受體Ⅱ(TNF RⅡ)基因表達的影響。</p><p

8、><b>　　1 實驗材料</b></p><p><b>　　1.1 動物</b></p><p>　　健康雄性Wistar大鼠77只,3月齡,體重200～300 g,湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。</p><p><b>　　1.2 主要試劑</b></p><p

9、>　　免疫組化相關(guān)試劑：兔抗大鼠IL-1β單克隆抗體,兔抗大鼠IL-6單克隆抗體(Eptomics公司,美國)；兔抗大鼠TNF Receptor Type Ⅱ單克隆抗體(Prosci公司,美國)；SABC免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑(武漢博士德)。實時定量熒光RT-PCR相關(guān)酶類及試劑：細胞總RNA提取試劑Trizol(Gibco公司,美國),焦碳酸二乙酯DEPC(Promega公司,美國)；Olig(dT)15, dNTP混合

10、物(上海Sangon)；M-MuLV、RNA酶抑制劑(Promega公司,美國)；SYBR Green Ⅰ熒光染料(羅氏公司,瑞士)。</p><p><b>　　1.3 主要儀器</b></p><p>　　DU640核酸及蛋白分析儀(Beckman公司,美國)；721B型分光光度計(上海第三儀器廠)；7300實時熒光定量PCR儀 (ABI,美國)；高速低溫離心機

11、(Beckman公司,美國)；TY-80S脫色搖床(江蘇華峰儀器有限公司)；臺式離心機(Beckman公司,美國)。</p><p><b>　　2 實驗方法</b></p><p><b>　　2.1 分組</b></p><p>　　77只雄性Wistar大鼠,其中5只用于前列腺蛋白提純液的制備,其余72只隨機分6

12、組,分別為正常對照組、模型組、西藥組及三草安前湯大、中、小劑量組(以下簡稱“SCAQ大、中、小劑量組”),每組12只。</p><p>　　2.2 大鼠前列腺蛋白提純液的制備</p><p>　　參照文獻[2]方法。取實驗大鼠5只,無菌條件下剝?nèi)∏傲邢俳M織,生理鹽水洗凈,加入含0.5% TritonX-100的生理鹽水溶液,冰浴勻漿,10 000 r/min離心30 min。吸上清,比濁

13、法測定蛋白濃度。臨用時用0.01 mol/L pH 7.4 PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度至15 mg/mL。</p><p><b>　　2.3 模型制備</b></p><p>　　參照文獻[2]方法。大鼠乙醚麻醉,腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,多點皮下注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA(1∶1混懸液)1 mL,正常對照組皮下注射生理鹽水,30 d重復(fù)注射1次。第60日時每

14、組處死2只,取前列腺病理檢查,驗證造模是否成功。</p><p>　　2.4 藥物制備及給藥</p><p>　　三草安前湯由金錢草、益母草、白花蛇舌草、紅藤、虎杖、丹參、王不留行等藥物組成(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)。藥物經(jīng)高壓濃縮煎藥機煎煮后過濾濃縮,根據(jù)人-大鼠體表面積換算系數(shù)確定大、中、小劑量組,分別為4.45、2.23、0.89 g/mL原藥材量,按1 mL/100 g體

15、重劑量灌胃。西藥組給藥消炎痛(山西云鵬制藥有限公司,批號H14020771),劑量參照說明書,臨用時將藥搗碎,生理鹽水溶解并稀釋成0.9 mg/mL,按1 mL/100 g體重劑量灌胃。造模60 d后各組開始給藥,模型組及正常對照組用生理鹽水灌胃。30 d時處死大鼠。</p><p><b>　　2.5 樣本取材</b></p><p>　　末次給藥后24 h處死大

16、鼠,剝離前列腺并稱重,1/3組織置DEPC水中漂洗3次,迅速入液氮保存待提取總RNA,其余2/3組織入甲醛固定,石蠟包埋切片,病理切片HE染色,免疫組織化學(xué)染色。</p><p>　　2.6 免疫組化檢測炎癥因子表達</p><p>　　根據(jù)SABC試劑盒操作說明書進行。</p><p>　　2.7 前列腺組織總RNA的提取及cDNA的制備</p>

17、<p>　　根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書操作。</p><p><b>　　2.8 引物</b></p><p>　　采用實時熒光定量RT-PCR的方法,IL-1β、IL-6、TNF RⅡ、18S rRNA PCR引物根據(jù)相關(guān)基因的大鼠cDNA序列進行設(shè)計。引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件設(shè)計。&l

18、t;/p><p>　　2.9 實時熒光定量RT-PCR方法檢測前列腺炎炎癥因子的基因表達</p><p>　　取反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2 μL為模板進行PCR反應(yīng)檢測炎癥因子基因表達。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR minister 20 μL,上、下游引物各1 μL(0.25 μmol/L),去離子水16 μL。充分混勻后加入cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：①95

19、℃ 10 min；②95 ℃變性15 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,40循環(huán)；③85 ℃檢測熒光。溶解曲線分析,95 ℃ 1 min,65 ℃ 1 min,以0.1 ℃/s的速度升高溫度至95 ℃,連續(xù)檢測熒光。擴增結(jié)束后分析溶解曲線,在溶解曲線上具有(85±0.8)℃ Tm峰判斷為PCR擴增的單一性。同時設(shè)無模板對照、無RT對照及陽性對照。目的基因mRNA定量：取一定量的cDNA模板,分別2、5、8、1

20、0倍稀釋,依次進行實時PCR擴增,建立標準曲線,以β- actin mRNA的模板量為參照,計算目的基因的相對模板數(shù)。</p><p><b>　　3 統(tǒng)計學(xué)方法</b></p><p>　　實驗數(shù)據(jù)用x±s表示,采用方差分析,組間比較用q檢驗。全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。</p><p&g

21、t;<b>　　4 結(jié)果</b></p><p><b>　　4.1 一般情況</b></p><p>　　造模前每組大鼠12只,造模及灌胃過程中模型組死亡1只,SCAQ小劑量組死亡1只,60 d時為評估造模情況每組處死2只,最后剩余正常組10只,模型組9只,西藥對照組10只, SCAQ小劑量組9只, SCAQ中劑量組10只,SCAQ大劑量組

22、10只。所有動物于給藥后30 d時處死。</p><p>　　4.2 各組大鼠前列腺組織白細胞介素-1β、白細胞介素-6及腫瘤壞死因子受體Ⅱ蛋白表達</p><p>　　IL-1β的棕色的陽性反應(yīng)主要在前列腺腺泡上皮細胞的胞漿或間質(zhì),細胞核不染色,部分組織還可見陽性反應(yīng)的條索狀結(jié)構(gòu)；IL-6在正常前列腺組織中有少量表達,主要表達細胞為腺腔內(nèi)上皮細胞；TNF RⅡ表達主要存在于腺體上皮細胞

23、胞膜上。結(jié)果見表1。表1 三草安前湯對CAP模型大鼠前列腺組織炎癥因子蛋白表達水平的影響(略)注：與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與正常組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01(下同)</p><p>　　4.3 各組大鼠前列腺組織白細胞介素-1β、白細胞介素-6及腫瘤壞死因子受體ⅡmRNA表達(見表2)</p><p>　　運用實時熒光定量PCR方法分析了三草安前湯治

24、療后CAP大鼠IL-1β、IL-6、TNF RⅡmRNA在前列腺組織中的表達。將樣品進行系統(tǒng)稀釋擴增后做標準曲線來確定各基因和β-actin mRNA的相對表達量,在不同稀釋度的樣品中擴增了目的基因的cDNA,在PCR反應(yīng)中,低濃度的cDNA導(dǎo)致熒光信號增長較慢,每個反應(yīng)都使用β-actin作為內(nèi)對照。SCAQ各劑量組以及西藥組治療后IL-1β、IL-6、TNF RⅡ mRNA在模型大鼠前列腺組織中的表達情況見表2。表2 三草安前湯對

25、CAP模型大鼠前列腺組織炎癥因子mRNA表達水平的影響(略)</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　有研究表明,CAP患者前列腺分泌物或精液中可出現(xiàn)某些炎癥因子水平變化[3-4]。本研究結(jié)果顯示,CAP模型大鼠存在炎癥因子IL-1β、IL-6、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ(sTNF RⅡ)表達增高的現(xiàn)象,提示炎癥因子的參與是CAP發(fā)病的重要機

26、制之一。在表達陽性的炎癥因子中,IL-1β、IL-6可促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放[5-6]；sTNF RⅡ作為炎癥因子受體參與調(diào)節(jié)細胞因子釋放以及促炎因子、抗炎因子的平衡[7]；尤其TNF-α、IL-1β被認為是慢性前列腺炎癥持續(xù)存在的標志[8]。本研究中僅檢測到IL-1β增高而TNF-α不增高,根據(jù)檢測結(jié)果中IL-6、sTNF RⅡ表達增強的結(jié)果,推測可能原因一是TNF-α多參與急性炎癥反應(yīng)過程,或在炎癥程度較重的情況下

27、表達增高,而長期的炎癥狀態(tài)下TNF-α并不增高；二是TNF-α可促進IL-6的分泌,雖然二者可以協(xié)同加劇炎癥反應(yīng),但IL-6持續(xù)表達增高又可下調(diào)TNF-α的合成；三是炎癥因子的動態(tài)平衡作用,可能與sTNF RⅡ表達增強可抑制TNF-α表達增加有關(guān)。</p><p>　　CAP屬中醫(yī)“精濁”范疇。中醫(yī)學(xué)認為其基本病機是濕熱瘀阻,治宜清熱利濕、活血化瘀。三草安前湯方中金錢草味甘、淡,氣微寒,歸腎、膀胱經(jīng),功能清熱利濕

28、,通淋消腫,為君藥。益母草味苦、辛,氣微寒,歸肝、心、膀胱經(jīng),有活血兼利水濕之功,為臣藥。王不留行味苦氣平,歸肝、胃經(jīng),善通利血脈,有活血通絡(luò)之功；白花蛇舌草味微苦,氣寒,清熱解毒、利濕散結(jié)；紅藤味苦、氣平,清熱解毒、活血止痛；虎杖味苦、氣寒,清熱解毒、活血祛瘀；丹參味苦、氣微寒,有活血化瘀作用,共為佐使。全方合用,共奏清熱利濕、活血化瘀之功。本研究結(jié)果顯示,三草安前湯可顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表達水平；TN

29、F RⅡmRNA出現(xiàn)下調(diào),但sTNF RⅡ蛋白水平也同時出現(xiàn)下調(diào),sTNF RⅡ來源于細胞膜TNF RⅡ,并可通過競爭TNF RⅡ發(fā)揮保護性作用,兩者均降低表明三草安前湯并不能直接參與TNF RⅡ或s TNF RⅡ的調(diào)控,而是治療后TNF-α水平降低,通過機體TNF-α、TNF R、sTNFR體系的反饋作用間接導(dǎo)致TNF RⅡ表達的降低。由此可見,參與免疫調(diào)節(jié)是三草安前湯治療CAP的機理之一。</p><p>&

30、lt;b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] 袁軼峰.三草安前湯直腸滴注治療濕熱下注型慢性前列腺炎的臨床觀察[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,(1)：35－36.</p><p>　　[2] 陳 磊,夏衛(wèi)平,周智恒.自身免疫性前列腺炎對大鼠前列腺形態(tài)學(xué)與炎性基因表達的影響[J].中華男科學(xué)雜志,2007,13(5)：444－448.</p>&

31、lt;p>　　[3] Motrich RD, Maccioni M, Molina R, et al. Presence of INFgamma- secreting lymphocytes specific to prostate antigens in a group of chronic prostatitis patients[J]. Clin Immunol,2005,116(2)：149－157.</p>

32、<p>　　[4] Hochreiter WW, Weidner W. Prostatitis-a frequently unrecognized disease[J]. Ther Umsch, 2006,63(2)：117－121.</p><p>　　[5] Pope RM, Tschopp J. The role of interleukin-1 and the inflammasome in

33、gout：implications for therapy[J]. Arthritis Rheum,2007,56(10)：3183－3188.</p><p>　　[6] Park JY, Pillinger MH. Interleukin-6 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Bull NYU Hosp Jt Dis,2007,65(Suppl 1

34、)：S4－S10.</p><p>　　[7] Gupta S, Gollapudi S. Molecular mechanisms of TNF-alpha-induced apoptosis in aging human T cell subsets[J]. Int J Biochem Cell Biol,2005,37(5)：1034－1042.</p><p>　　[8] Nadl