HAL1基因轉(zhuǎn)化煙草提高煙草耐鹽性的研究.pdf

1、鹽堿地是巨大的潛在資源，綠化鹽堿地是擴(kuò)大耕地面積，進(jìn)一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境的重要措施。利用基因工程手段培育能在鹽堿地上種植的植物，是利用鹽堿地的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。HAL1基因是釀酒酵母中的重要耐鹽因子，其表達(dá)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度。盡管HAL1基因本身不是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但在鹽脅迫下能與ENA1基因協(xié)同作用促進(jìn)Na+外排，與其它轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)協(xié)同作用增加K+的吸收，保持細(xì)胞內(nèi)低的Na+/K+比，以減輕Na+毒害，因而在植物耐鹽基因工程上

2、具有很大的潛力。 本研究首先將耐鹽基因HAL1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404和C58C1中，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將HAL1基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草，探索農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件及其影響因素，并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下： 1.將含有目的基因的質(zhì)粒ProkⅡ?qū)敫┺r(nóng)桿菌LBA4404和C58C1中。兩個(gè)菌株均以70mmo/LCaCl2為轉(zhuǎn)化溶液，OD600為0.5～0.6的YEB培養(yǎng)基制備的感受態(tài)細(xì)

3、胞最佳。LBA4404感受態(tài)細(xì)胞和10ng質(zhì)粒DNA于0℃共放置30min，液氮速凍5min，37℃熱激5min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)1.4×105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。C58C1感受態(tài)細(xì)胞和20ng質(zhì)粒DNA于0℃共放置10min，液氮速凍1min，37℃熱激1min轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)1.33×105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。 2.以煙草為實(shí)驗(yàn)材料，建立了較為理想的再生體系。秦選1號(hào)以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L，秦?zé)?5

4、以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L作為遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化培養(yǎng)基。經(jīng)Kan梯度篩選試驗(yàn)，以20mg/L和30mg/LKan分別作為秦選1號(hào)和秦?zé)?5抗性芽的篩選濃度。以20mg/LKan作為兩者轉(zhuǎn)化植株生根時(shí)的篩選濃度。 3.優(yōu)化了HAL1基因轉(zhuǎn)化煙草遺傳體系。取40～60d葉齡的秦選1號(hào)再生苗葉圓片不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，用攜帶目的基因的LBA4404農(nóng)桿菌菌液稀釋100×，浸泡1min來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。外植體與農(nóng)

5、桿菌共培養(yǎng)2d后用滅菌蒸餾水充分沖洗，然后于2％的NaClO中浸泡15min，用滅菌蒸餾水沖洗4～5次，置800mg/LCb+0.1％的甘露醇中浸泡約12h來(lái)進(jìn)行除菌。采用早期篩選和后期篩選獲得了Kan抗性植株。 4.經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)有6個(gè)獲得約900bp的特異性擴(kuò)增譜帶，初步證明HAL1基因已整合到煙草基因組中。耐鹽試驗(yàn)表明，在檢測(cè)的轉(zhuǎn)化植株中有83.7％的轉(zhuǎn)基因植株在0.8％～0.9％NaCl的生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，47.5