化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)傳染病

1、化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)傳染病,更靈敏、更特異、更準(zhǔn)確,,放免,酶聯(lián)免疫,化學(xué)發(fā)光,熒光免疫,60年代,70年代,80年代,90年代,免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展,國產(chǎn),進(jìn)口,酶促化學(xué)發(fā)光,直接化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用前景,.敏感度高，(10-21mol/L)超過酶免，熒光免疫等方法.精密度，準(zhǔn)確度超過放免，酶免，熒光免疫等方法.試劑穩(wěn)定，無放射性，污染或生物毒性；.測(cè)定耗時(shí)短，方便快速提供結(jié)果報(bào)告；.測(cè)定項(xiàng)目齊全； 已發(fā)展成全自動(dòng)的

2、測(cè)定系統(tǒng)。,,,,包被技術(shù)的發(fā)展---磁微粒子,包被磁微粒 標(biāo)記異魯米諾,Eg:雙抗夾心法分析模式 磁微粒子上包被的抗體與待檢測(cè)抗原及異魯米諾標(biāo)記抗體結(jié)合,提升檢測(cè)功能靈敏度增加檢測(cè)線性范圍比吖啶酯更穩(wěn)定延長試劑效期,,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,,微粒包被,液相反應(yīng),磁微粒、直接化學(xué)發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)充分速度更快,酶標(biāo)板，板式,磁微粒，納米級(jí)，均相,,,CLIA,板式載量,Y,Y,Y,Y

3、,Y,Y,Y,Y,Y,,磁微粒子直接化學(xué)法Ag/Ab,酶標(biāo)板發(fā)光板Ag/Ab,,,微粒子化學(xué)發(fā)光法抗體載量優(yōu)勢(shì),,,,,微粒子化學(xué)發(fā)光原理,磁性微粒子及其分離技術(shù),磁性微粒子技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：快速分離結(jié)合相與游離相提高與Ag或Ab包被親和力提高接觸表面積/反應(yīng)容量比例，實(shí)現(xiàn)微量分析不需要抗體分離步驟，杜絕干擾與交叉反應(yīng)允許共價(jià)耦合反應(yīng)，因此可以檢測(cè)大/小分子的各種物質(zhì)成分能應(yīng)用各種分析設(shè)計(jì)與反應(yīng)模式，擴(kuò)大應(yīng)用范圍

4、如：夾心法，竟?fàn)幏?，抗體檢測(cè)法等利于檢測(cè)自動(dòng)化與微量分析,磁微粒子直接化學(xué)發(fā)光是最新一代免疫檢測(cè)新技術(shù)具有液相、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)通過多中心的臨床評(píng)估，基本上驗(yàn)證了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、腫瘤標(biāo)志物、甲狀腺功能等項(xiàng)目的臨床可用性多家臨床試驗(yàn)顯示產(chǎn)品的質(zhì)量不亞于進(jìn)口的雅培、羅氏和西門子等廠家的產(chǎn)品媲美。,1）磁性微粒子技術(shù)： 便于分離，反應(yīng)均勻，提高靈敏度2）泉涌內(nèi)外壁清洗技術(shù)：

5、 最小的交叉污染率3）試劑盒蓋設(shè)計(jì)： 減少人工操作誤差和交叉污染，避免試劑揮發(fā)影響結(jié)果準(zhǔn)確性4）試劑冷藏系統(tǒng)： 保證在儀器操作的過程中試劑能夠一直保持穩(wěn)定5）磁性分離技術(shù)： 保證了清洗效率，對(duì)于靈敏度要求極高的標(biāo)記免疫分析是十分關(guān)鍵的,技術(shù),雅培 免疫項(xiàng)目,,,甲狀腺功能甲狀腺素三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素游離三碘

6、甲狀腺原氨酸促甲狀腺素性腺激素人絨毛膜促性腺激素催乳素雌二醇卵泡刺激素黃體生成素孕酮睪酮,腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特異性抗原游離前列腺特異性抗原糖類抗原125糖類抗原15-3糖類抗原19-9β2微球蛋白鐵蛋白神經(jīng)元特異性烯醇化酶人鈣結(jié)合蛋白腫瘤相關(guān)抗原72-4鱗狀上皮癌相關(guān)抗原細(xì)胞角蛋白CYFRA 21-1,心血管及心肌標(biāo)志物N末端腦鈉肽肌鈣蛋白Ⅰ肌酸激酶同工酶C反應(yīng)蛋

7、白心肌脂肪酸結(jié)合蛋白脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2髓過氧化物酶肌紅蛋白肝纖維化四項(xiàng)透明質(zhì)酸Ⅲ型前膠原N端肽Ⅳ型膠原蛋白層粘連帶白,傳染病乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒e抗體乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒表面抗體乙型肝炎病毒表面抗原丙型肝炎抗體（HCV）梅毒抗體（TP）人類免疫缺陷病毒抗體糖代謝類胰島素C-肽,全自動(dòng)、管式、直接化學(xué)發(fā)光法 ------

8、---------特異性強(qiáng)、性能穩(wěn)定 超長時(shí)間無人值守 （1）試劑區(qū)15個(gè)試劑位， （2）樣本區(qū)12 ╳ 12 = 144 個(gè)樣本位 （3）碼垛區(qū)一次性裝載720個(gè)反應(yīng)杯 測(cè)試中可隨時(shí)添加，隨時(shí)替換,,,,,,,,真正的急診功能，急診樣本，隨到隨測(cè)。測(cè)試速度高達(dá)220測(cè)試/小時(shí)原試管上樣，無需倒管。全封

9、閉反應(yīng)艙，有效減少外界環(huán)境干擾和污染全中文軟件，圖標(biāo)式界面，操作更簡便綜合測(cè)試成本低,管式、微粒子包被技術(shù)，反應(yīng)速度更快，結(jié)果更準(zhǔn)確。ELISA法檢測(cè)乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照2010年《藥典》規(guī)定反應(yīng)時(shí)間至少要2小時(shí)30分鐘；而全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光試劑則不到30分鐘即可完成。穩(wěn)定性更好特異性更好,,大部分國際一流廠家也都采用直接發(fā)光法：,羅 氏西門子雅 培…….,,傳染病試劑傳統(tǒng)酶免法和微粒子化學(xué)發(fā)

10、光法對(duì)比,參比試劑：雅培I2000,試劑性能多中心臨床評(píng)估（乙肝）,免疫測(cè)定試劑的關(guān)鍵點(diǎn),作為免疫反應(yīng)，抗原抗體的選擇是整個(gè)免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關(guān)鍵如何選擇好一個(gè)抗體(單克隆或多克隆)去檢測(cè)一個(gè)被檢物質(zhì)，而不與非常相似結(jié)構(gòu)的其它代謝產(chǎn)物有交叉反應(yīng),或著是一些沒有臨床意義的分解產(chǎn)物等，這是分析設(shè)計(jì)的重點(diǎn)中之重點(diǎn)。批內(nèi)、批間的分析重現(xiàn)性。,,,,AFP,,,,HBsAg,4.50%,1.79%,4.91%,2.14%,,,批內(nèi)

11、,批間,微粒子化學(xué)發(fā)光試劑的精密度,參比試劑：雅培,試劑性能多中心臨床評(píng)估,N=500，參比試劑：雅培I2000,試劑性能多中心臨床評(píng)估,丙型肝炎抗體診斷試劑,丙肝病毒復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)： 決定了抗體譜的差異，從而為丙肝抗體檢測(cè)敏感度的提高帶來了困難。,丙肝診斷試劑目前存在的問題,1、灰區(qū)標(biāo)本的困惑2、陽性標(biāo)本的漏檢,問題形成的技術(shù)原因---灰區(qū)的形成,1、重組抗原的原因 （1）融合蛋白 （2）大腸

12、桿菌雜蛋白2、第二抗體的非特異反應(yīng) （1）酶標(biāo)抗體對(duì)固相載體的直接吸附 酶標(biāo)二抗對(duì)于丙肝抗體是非特異的，和各種人IgG均能反應(yīng)結(jié)合。 （2）個(gè)別標(biāo)本中IgG濃度過高 多聚體的混合：E-E、E-Ab、E-Ab-E、E-Ab-E-Ab ，既引起本底背景，又阻遏抗原抗體反應(yīng),問題形成的技術(shù)原因---陽性標(biāo)本的漏檢,1、關(guān)于靈敏度的兩個(gè)概念 （1）分析靈敏度

13、 決定因素： a.單個(gè)抗原決定族的抗原性強(qiáng)弱。 b.試劑盒的信號(hào)放大能力 （2）流行病學(xué)敏感度 決定因素： a.抗原片段的種類是否齊全。 b.是否含構(gòu)像抗原。 c.分析靈敏度的高低。,丙型肝炎病毒的基因

14、結(jié)構(gòu),ELISA-1st RIBA-1st,ELISA-2stRIBA-2st,ELISA-3stRIBA-3st,2、抗原片段種類不全,3、包涵體抗原，抗原性弱4、缺乏構(gòu)像表位5、原核表達(dá)分子量小，抗原表位有限6、抗原非糖基化，穩(wěn)定性差7、信號(hào)放大能力有限8、固相載體形成的空間位阻,問題形成的技術(shù)原因---陽性標(biāo)本

15、的漏檢,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑的關(guān)鍵技術(shù),1、包被和標(biāo)記實(shí)現(xiàn)雙特異，以降低假陽性率，并提高分析敏感度。2、通過整體系統(tǒng)優(yōu)化，進(jìn)一步擴(kuò)大陰陽反差，使結(jié)果判讀涇渭分明。,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑技術(shù)策略---灰區(qū)的解決,1、酵母真核表達(dá)抗原，高效減少灰區(qū)標(biāo)本 eg: E.coli與Pichia pastoris 檢測(cè)國標(biāo),Anti HCV重組 NS3 抗原,NS3 HCV病毒的最重要的抗

16、原 通過酵母真核系統(tǒng)成功的表達(dá)NS3抗原, 多重折疊以達(dá)到高度的免疫活性 高純度; 易于直接標(biāo)記,2、針對(duì)Fab端的單特異性抗體標(biāo)記物一般二抗和單特異抗體的對(duì)比,,3、板式固相載體升級(jí)為管式磁微粒子包被 ★ 包被量更富足 ★ 管式液相反應(yīng)更充分 ★ 更有效的解決空間位阻效應(yīng),,4、光信號(hào)檢測(cè)，提高信噪比 信號(hào)放大代替靶標(biāo)放大，減少靶標(biāo)放大帶

17、來的非特異性反應(yīng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ELISA的信噪比。,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑---降低漏檢率,1、在CORE、NS3、NS4、NS5的基礎(chǔ)上增加了E1區(qū)，保證抗原片段的齊全2、pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)帶來以下優(yōu)勢(shì) （1）非包涵體而可溶性表達(dá)，抗原性強(qiáng) （2）因糖基化而提高穩(wěn)定性 （3）分子量大，抗原表位豐富 （4）具有構(gòu)像抗原表位，而提高檢出率3、磁微粒子標(biāo)記抗原增加抗原抗體的反應(yīng)強(qiáng)度,新型丙肝化學(xué)發(fā)光

18、試劑檢測(cè)國家參考品符合率對(duì)比,新型雙特異丙肝化學(xué)發(fā)光診斷試劑臨床驗(yàn)證報(bào)告,丙肝化學(xué)發(fā)光試劑臨床對(duì)比試驗(yàn)報(bào)告,對(duì)照試劑：雅培I2000SR試驗(yàn)單位：包頭市中心醫(yī)院,,,RIBA試驗(yàn)結(jié)果：陰性。,定性檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果判讀-有反應(yīng)性和無反應(yīng)性,定性項(xiàng)目一般以陰陽性作為結(jié)果判斷的基礎(chǔ)。陰陽性判讀基于量化的結(jié)果，主觀進(jìn)行陰陽性的定義。真正的確認(rèn)的陰陽性需要通過金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法才能確證。HCV的確證實(shí)驗(yàn)RIBA（重組免疫印跡法）HIV的確證

19、實(shí)驗(yàn)Western-Blot（蛋白質(zhì)印跡法）感染初期，可能使用確證實(shí)驗(yàn)也無法得出準(zhǔn)確的陰陽性結(jié)論。檢驗(yàn)方法的局限性，使用有反應(yīng)性和無反應(yīng)性來評(píng)估該樣本針對(duì)該檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果。半定量檢測(cè)，通過病員的動(dòng)態(tài)隨訪，相隔一定時(shí)間再行檢測(cè)，可通過S/CO值的變化程度來進(jìn)行確證。,高特異經(jīng)典免疫學(xué)原理，單克隆抗體技術(shù)大分子采用夾心法分析小分子采用競(jìng)爭法分析專利的磁性分離技術(shù),高靈敏采用最靈敏、最穩(wěn)定的直接發(fā)光級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)采用最持久

20、最穩(wěn)定的發(fā)光劑ABEI 采用磁性微粒子技術(shù)，擴(kuò)大包被面積,高穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定，持續(xù)高質(zhì)量試劑, 無需預(yù)處理穩(wěn)定，持久的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有效期長機(jī)上試劑冷藏系統(tǒng)，試劑有效期長膠膜試劑盒，確保試劑穩(wěn)定,高準(zhǔn)確超靈敏光電倍增管檢測(cè)發(fā)光信號(hào)發(fā)光3秒內(nèi)完成，原位檢測(cè)泉涌式內(nèi)外壁清洗系統(tǒng)，嚴(yán)格防止交叉污染(<1ppm),降低診斷成本，惠及民生全自動(dòng)操作，重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化高特異性、高靈敏度，避免漏檢誤診,小結(jié)全自動(dòng)微粒子化