本科寄生蟲實(shí)驗(yàn)五

1、實(shí)驗(yàn) 五,-瘧原蟲 Malaria Parasite -弓形蟲 Toxoplasma-人芽囊原蟲 Blastocystis hominis,. 掌握間日瘧原蟲(P.v)紅細(xì)胞內(nèi)期的形態(tài)特點(diǎn)。. 掌握惡性瘧原蟲(P.f)早期滋養(yǎng)體和配子體的形態(tài)特點(diǎn)。. 認(rèn)識(shí)瘧原蟲在肝細(xì)胞內(nèi)(即紅外期)及在蚊體內(nèi)發(fā)育階段的形態(tài)特點(diǎn)。. 練習(xí)血片的制作及染色。. 熟悉弓形蟲滋養(yǎng)體及包囊的形態(tài)特征。. 熟悉隱孢子蟲卵囊形態(tài)特征，了解改良抗酸染色法

2、。. 熟悉肉孢子蟲卵囊、孢子囊形態(tài)特征。. 了解人芽囊原蟲形態(tài)特征。 . 拷貝“標(biāo)本復(fù)習(xí)”文件夾，做好考前復(fù)習(xí)。. 班長(zhǎng)在下次實(shí)驗(yàn)課前2-3天，到106館一樓準(zhǔn)備室領(lǐng)取玻片和透明膠。,the Purpose and Requirements,間日瘧原蟲(Plasmodium vivax,P.v),瘧原蟲生活史發(fā)育包括：,,紅細(xì)胞外期 Exoerythrocytic stage,-在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂體增殖；-間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲

3、速發(fā)型子孢子紅外期發(fā)育的時(shí)間分別是6-8天和9天，而遲發(fā)型子孢子為數(shù)月至年余；惡性瘧原蟲6天，三日瘧原蟲11-12天。,紅內(nèi)期 Erythrocytic cycle,,,,,,,早期滋養(yǎng)體/環(huán)狀體 Early trophozoit/ Ring form,,晚期滋養(yǎng)體/大滋養(yǎng)體 Large trophozoite,,裂殖體 Schizont,裂體增殖周期,配子體 Gametocyte,P.v 紅細(xì)胞內(nèi)期發(fā)育,,,薛氏小點(diǎn)（紅色）,,瘧色素

4、（棕褐色）,-經(jīng)姬氏或瑞氏染色，基本結(jié)構(gòu)如下：,,瘧原蟲,,紅細(xì)胞（紅色）,,紅細(xì)胞變化,-被寄生紅細(xì)胞變化：體積、顏色、薛氏小點(diǎn)-瘧原蟲：核數(shù)目、胞質(zhì)形狀、瘧色素,( Early trophozoit/Ring form, R ),P.v 早期滋養(yǎng)體/環(huán)狀體,. 核1個(gè),. 胞質(zhì)環(huán)形,胞質(zhì)與核之間有空泡,呈戒指狀,. 大小約為紅細(xì)胞直徑的1/3.,. 被寄生紅細(xì)胞無明顯改變.,( Large trophozoite, T ),P

5、.v 晚期滋養(yǎng)體/大滋養(yǎng)體,. 核1個(gè),. 胞質(zhì)增多變形,形狀不規(guī)則，有空泡，. 胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色煙絲狀的瘧色素.,. 被寄生紅細(xì)胞體積稍增大,色淡,出現(xiàn)鮮紅薛氏小點(diǎn).,( Young schizont, YS ),P.v 未成熟裂殖體,. 核分裂, 數(shù)目<12個(gè),. 胞質(zhì)漸變圓，空泡消失,. 瘧色素分散在胞質(zhì)中.,. 被寄生紅細(xì)胞體積增大,色淡,出現(xiàn)鮮紅薛氏小點(diǎn).,( Mature schizont, MS ),P.

6、v 成熟裂殖體,. 核分裂, 數(shù)目>12個(gè),.胞質(zhì)分裂,圍繞核,形成裂殖子,數(shù)目12-24個(gè),.瘧色素集中成1-2團(tuán)，位于蟲體中央或一側(cè).,. 被寄生紅細(xì)胞體積增大,色淡,出現(xiàn)鮮紅薛氏小點(diǎn).,瘧色素→,雄配子體,雌配子體,.核1個(gè),疏松,近中央,,.核1個(gè),致密,偏向一側(cè),,.細(xì)胞質(zhì)幾乎充滿脹大的紅細(xì)胞，瘧色素均勻分布于其中.,. 被寄生紅細(xì)胞體積增大,色淡, 鮮紅薛氏小點(diǎn)明顯.,P.v 配子體(Gametocyte,G),惡

7、性瘧原蟲Plasmodium falciparum,P. f,P.f 紅細(xì)胞內(nèi)期發(fā)育,,,,,,,36-48 h,,,,,,,,,,外周血中不易見到！,P.f 早期滋養(yǎng)體/環(huán)狀體,( Early trophozoit; Ring form, R ),. 核1個(gè),. 胞質(zhì)環(huán)形,胞質(zhì)與核之間有空泡,呈戒指狀,. 大小約為紅細(xì)胞直徑的1/5.,多蟲型,雙核型,邊緣型,P.f 配子體(Gametocyte,G),瘧色素集中于核的周圍。,瘧

8、色素散于核的周圍 。,-被寄生的紅細(xì)胞因破裂而不見或僅見一部分。,一個(gè)紅細(xì)胞被P.f and P.v 同時(shí)感染,,,一個(gè)紅細(xì)胞有多個(gè)瘧原蟲寄生, 注意與裂殖體鑒別。,In female anopheline :在雌性按蚊體內(nèi)發(fā)育,雄配子體出絲Exflagellation of macrogametocyte,蚊胃上囊合子（卵囊）,卵囊,子孢子,,-子孢子Sporozoite：,-子孢子為感染階段；-間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲子孢子具有

9、兩種類型：速發(fā)型和遲發(fā)型。,-Thin blood film / thick blood film stained with Giemsa or Wrights stain.,-Thick blood film,-Thin blood film,Laboratory diagnosis,-具體操作見后面實(shí)驗(yàn)操作。,剛地弓形蟲Toxoplasma gondii,弓形蟲滋養(yǎng)體-速殖子Tachyzoite,,,(吉氏染色),弓形蟲包囊Tis

10、sue cyst of Toxplasma gondii,弓形蟲卵囊 Oocyst of Toxplasma gondii,改良抗酸染色法,.卵囊 Oocyst,隱孢子蟲Cryptosporidium,豬人肉孢子蟲Sarcocystis suihominis,肉孢子囊Sarcocyst,人芽囊原蟲Blastocystis hominis,-碘染色,患者女性，47歲，因外傷于1997年4月5日入院手術(shù)。術(shù)前血常規(guī)，血紅蛋白10.3g/

11、L，紅細(xì)胞3.35×1012/L，白細(xì)胞21.6×109/L。術(shù)中輸血400ml，術(shù)后第9天起不規(guī)則發(fā)熱，實(shí)驗(yàn)室檢查血紅蛋白8.6g/L，紅細(xì)胞2.7×1012/L，白細(xì)胞15.2×109/L，晚幼紅細(xì)胞30/100個(gè)白細(xì)胞。成熟紅細(xì)胞易見破碎紅細(xì)胞，紅細(xì)胞內(nèi)查見瘧原蟲小滋養(yǎng)體，確診為惡性瘧。經(jīng)三聯(lián)抗瘧治療后痊愈。。,Case discussion 1,思考題：1.該患者有可能經(jīng)什么方式感染惡性瘧

12、原蟲？ 2.本病的診斷依據(jù)是什么？ 3.惡性瘧與間日瘧的治療一樣嗎？,患者男性，30歲，因頭痛高熱3天入院治療，剛援非回國(guó)。血常規(guī)檢查：血紅蛋白15g/L，紅細(xì)胞4.54×1012/L。入院后第2天出現(xiàn)昏迷，持繼高熱，反復(fù)多次鏡檢，于入院后第4天在紅細(xì)胞內(nèi)查見瘧原蟲小滋養(yǎng)體，同時(shí)在骨髓涂片中查見瘧原蟲小滋養(yǎng)體，確認(rèn)為惡性瘧原蟲，會(huì)診后確診為惡性腦型瘧。,Case discussion

13、 2,思考題：1.從瘧疾流行區(qū)（如非洲）工作、旅游、學(xué)習(xí)歸國(guó)的人員，如發(fā)現(xiàn)原因不明的高熱，應(yīng)考慮其可能患了什么??？應(yīng)該做什么檢查？ 2.試述腦型瘧的臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制？,女，48歲，因右眼突然失明20余天入院。病人無誘因突然出現(xiàn)右眼失明，無眼部紅、痛、閃光癥狀。入院后查：右眼視力：光感、外眼無異常，玻璃體出血。靜脈點(diǎn)滴血栓通，口服活血化疲、軟堅(jiān)散結(jié)中藥，右眼視力無提高。局麻下行“右眼玻璃體切割術(shù)”，手術(shù)順利。術(shù)后

14、第1天，右眼視力0.2，結(jié)膜充血，角膜透明；瞳孔藥物性散大，玻璃體清亮，眼底見視盤界清，色正常，C/D = 0.2，視網(wǎng)膜動(dòng)脈稍紅，A: V=1:2，顳下方視網(wǎng)膜可見陳舊性出血灶，考慮玻璃體出血即為此處出血灶滲入，局部伴色素沉著，脈絡(luò)膜萎縮；術(shù)后第3天視力0.5；術(shù)后兩次抽血查弓形體陽(yáng)性（PCR法）。追問病史，病人兒童時(shí)期視力正常，近來病人有養(yǎng)貓史4年，最后診斷：①右眼玻璃體出血；②弓形體性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎。,Case discussio

15、n 3,思考題：結(jié)合病例分析感染弓形蟲的可能途徑有哪些？,1. 臨床瘧疾發(fā)作與瘧原蟲的繁殖有何關(guān)系？2. 試討論引起瘧疾暴發(fā)性流行的原因。3. 簡(jiǎn)述如何診斷瘧疾？4. 剛地弓形蟲感染為何分布很廣？試述弓形蟲致病的特點(diǎn)？5.什么叫機(jī)會(huì)致病性原蟲？有哪些常見的機(jī)會(huì)性致病原蟲？6. 引起貧血的寄生蟲有哪些？致病機(jī)理？,Questions:,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）示教內(nèi)容： 1.間日瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)期各期，惡性瘧原蟲早期滋養(yǎng)體和配子體

16、、瘧原蟲囊合子、子孢子以及紅外期標(biāo)本：油鏡下觀 2.弓形蟲速殖子（吉氏染色）：油鏡下觀 3.隱孢子蟲卵囊（改良抗酸染色）：圖片示教 4.豬人肉孢子蟲肉孢子囊：高倍鏡下觀,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（二）實(shí)驗(yàn)操作：薄血涂片制作與染色 1.鼠瘧原蟲（Plasmodium bergheri 伯氏瘧原蟲）接種小白鼠：取液氮保種的伯氏瘧原蟲，解凍后用生理鹽水稀釋。在無菌操作的條件下，給健康小白鼠作腹腔內(nèi)注射，每只1ml，感染后3-

17、5天，外周血即可查到原蟲（由老師完成）。 2.薄血片制作：用剪刀剪去鼠尾未端少許，取潔凈玻片一張，從鼠尾取血一小滴置玻片中部，另取一張玻片作推片，將推片的短邊接觸血滴，待血液向兩側(cè)擴(kuò)散后，以兩玻片呈30-40°角，將推片自右向左勻速快捷向前推進(jìn)，即成薄血膜。理想的薄血膜應(yīng)是血量和寬度適中，平滑不起波浪，未端成舌形。,Preparation of blood film and stain,-血涂片制作和染色,--血 涂片

18、 制 作,Preparation of blood film and stain,1-3為薄血片制作；4-6為厚血片制作,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（二）實(shí)驗(yàn)操作：薄血涂片制作與染色,3.固定：待血片陰干后，用甲醇固定薄血膜，自然晾干。4.染色：按1毫升水加4滴吉氏原液的比例配制染液。將涂有血膜的玻片血膜面朝下，一端架在鐵絲上，用吸管滴注染液于玻板與血片之間，使染液與血膜完全接觸，染色20min。5.自來水輕輕沖洗血膜，晾干鏡檢。,-鏡下觀察血片的

19、操作步驟及注意事項(xiàng),,1. 10倍鏡下經(jīng)過觀察后選擇一較好的視野作為油鏡下觀察野，避免紅細(xì)胞嚴(yán)重重疊或太稀少的視野.,-鏡下觀察血涂片的操作步驟及注意事項(xiàng),2.油鏡下觀察時(shí)按固定方向，如從左到右或從右到左，將整張片觀察完(約30min)，以避免在同一部位重復(fù)看。,,,1. 10倍鏡下經(jīng)過觀察后選擇一較好的視野作為油鏡下觀察野，避免紅細(xì)胞嚴(yán)重重疊或太稀少的視野.,-鏡下觀察血片的操作步驟及注意事項(xiàng),2.油鏡下觀察時(shí)按固定方向，如從左到右或

20、從右到左，將整張片觀察完(約30min)，以避免在同一部位重復(fù)看。,,,1. 10倍鏡下經(jīng)過觀察后選擇一較好的視野作為油鏡下觀察野，避免紅細(xì)胞嚴(yán)重重疊或太稀少的視野.,3.發(fā)現(xiàn)目標(biāo)時(shí)，判斷是否為瘧原蟲，注意與血小板、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、細(xì)胞碎片、染液顆粒等鑒別。,,-鏡下觀察血片的操作步驟及注意事項(xiàng),2.油鏡下觀察時(shí)按固定方向，如從左到右或從右到左，將整張片觀察完(約30min)，以避免在同一部位重復(fù)看。,,,1. 10倍鏡下經(jīng)過觀察后選

21、擇一較好的視野作為油鏡下觀察野，避免紅細(xì)胞嚴(yán)重重疊或太稀少的視野.,3.發(fā)現(xiàn)目標(biāo)時(shí)，判斷是否為瘧原蟲，注意與血小板、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、細(xì)胞碎片、染液顆粒等鑒別。,4.肯定為瘧原蟲后，再依據(jù)形態(tài)特征分析是R、T、YS、MS or G。,,4.形態(tài)典型的拍片，存圖。,,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,附：伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)分布于非洲扎伊爾的加丹山區(qū)森林中，自然宿主為叢林鼠，蚊媒為杜氏按蚊。 紅內(nèi)期裂體增殖周期約24h，早期

22、滋養(yǎng)體為典型的環(huán)狀體，偶見雙核型，晚期滋養(yǎng)體近似圓形，阿米巴樣外形不典型，成熟裂殖體含裂殖子數(shù)在小鼠為6-10個(gè)，配子體形狀類似人間日瘧原蟲。瘧色素細(xì)小，黑色或金黃色。 多蟲寄生在同一紅細(xì)胞極為普遍(注意與裂殖體鑒別)。被寄生的紅細(xì)胞脹大。 實(shí)驗(yàn)室里長(zhǎng)期用紅內(nèi)期原蟲轉(zhuǎn)種，不易見到配子體。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,下課前特別要求： ①一定要用擦鏡紙蘸二甲苯擦拭油鏡頭和高倍鏡頭！ ②將標(biāo)本歸回到標(biāo)本架上！要注意左右槽對(duì)齊插入！

23、 ③將自已制做的鼠瘧原蟲玻片放入鋁鍋內(nèi)！,實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求:-拍攝圖片包括: ①P.v 的滋養(yǎng)體T、未成熟裂殖體YS、成熟裂殖體MS、配子體G中任選2個(gè)(如果找不到，可在自己做的鼠瘧血片上觀察拍片代替); ②P.f的R和G; ③弓形蟲滋養(yǎng)體.-標(biāo)注蟲期名稱（不需標(biāo)注結(jié)構(gòu)名稱），如下圖。,特別強(qiáng)調(diào)：一定要用擦鏡紙沾二甲苯擦拭干凈油鏡頭和高

24、倍鏡頭后，再離開教室。,附:本次課使用的縮寫符號(hào),--間日瘧原蟲 Plasmodium vivax, P.v--惡性瘧原蟲 Plasmodium falciparum, P. f --早期滋養(yǎng)體/環(huán)狀體 Early trophozoit/ Ring form, R --晚期滋養(yǎng)體/大滋養(yǎng)體 Large trophozoite, T --未成熟列殖體 Young schizont, YS --成熟列殖體 Mature schi