elisa基礎知識和注意事項解讀

1、2024/2/9,ELISA基礎知識和注意事項,,2024/2/9,類容,ELISA的基本原理和相關概念特別說說捕獲法ELISA結果的影響因素ELISA結果的處理,2024/2/9,ELISA的基本原理和相關概念,將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或 抗體后，這種酶標抗原或抗體既能保留與相應抗體或抗原結合的免疫活性，又同時保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感性。,20

2、24/2/9,ELISA的基本原理,抗原或抗體在體外結合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學活性而能相互特異性結合。,2024/2/9,抗原抗體復合物與酶標的二抗結合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關系，可進行定性和定量分析。,2024/2/9,ELISA的分類,測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙抗體夾心法。 測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法,2024/2/9,競爭法elisa,競爭法EL

3、ISA原理——標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，標本中的抗原含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，顯色越淺。要用于小分子抗原或半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。,2024/2/9,2024/2/9,雙抗體夾心法,雙抗體夾心法ELISA ——將特異性抗體包被于固相載體表面，與標本中相應抗原相結合，洗滌后再加入酶標的第二特異性抗體與抗原結合，加入底物后顯色。檢測測抗原要有至少具有2個抗原決定簇,2024/2/9,包被

4、特異性抗體,2024/2/9,雙抗原夾心法,雙抗原夾心法ELISA——檢測標本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體） 。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標本中特異性IgM和IgG型抗體結合，洗滌后加入酶標的特異性抗原與相應的抗體結合，洗滌后加入底物顯色,2024/2/9,2024/2/9,間接法,間接法 ELISA（Indirect ELISA）——將特異性抗原包被于固相載體表面，與標本中相應特異性抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗人Ig

5、G或IgM抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色。酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子只需要變換包被抗原，就可用一種酶標二抗檢測各種與抗原結合的抗體,2024/2/9,2024/2/9,捕獲法,ELISA（Capture ELISA）——專門用來檢測IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標本中所有人IgM抗體結合，洗滌后加入特異性抗原與相應的特異性IgM抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗原特異性抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色

6、。,2024/2/9,,,2024/2/9,區(qū)別理解,檢測抗原？抗體？ 包被什么？ 標記什么？,2024/2/9,間接法和捕獲法比較,間接法：假陰性，假陽性捕獲法：酶標抗體的要求較高,2024/2/9,間接法的假陽性,,2024/2/9,間接法的假陰性,,麻疹IgG,,,,,,,,,,,,麻疹抗原,麻疹IgM,酶標抗人IgM抗體,陽性結果,假陰性結果,2024/2/9,ELISA的有關名詞概念,質控血清：質控血清是為了

7、對實驗結果進行控制而配制的血清。質控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內的陽性對照。若用稀釋的血清作為質控血清，應考慮稀釋基質成分對結果的影響。因質控血清與臨床標本不一致，應該注意對結果的分析，應該注意質控血清只能用于質控活動，不可用于標定儀器或評價方法。用于室內質控的質控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質控品。,2024/2/9,,室內質控：實驗室內部使用控制實驗

8、結果可靠性的一種質量控制。室間質評：用于考核各個實驗室結果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質評。可以理解為 “各個實驗室的質量評比”。,2024/2/9,,臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據后應用統(tǒng)計學方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA 抗

9、–HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。,2024/2/9,,靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%測定方法及表示方法：靈敏度標準品、質控血清、陽性標本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標本陽性率。,2024/2/9,,特異性： 真陰性標本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%測定及表示方法：質控

10、血清、血清盤、臨床標本陰性率。,2024/2/9,Elisa結果的影響因素,試劑盒的選擇 標本 加樣與稀釋 溫育 洗版 顯色 質控,2024/2/9,試劑盒的選擇,同行的試劑使用情況 上級部門對試劑實際使用的綜合評價 使用臨界值質控血清進行實際檢測比較,選擇林敏度和準確度高、特異性強試劑盒,2024/2/9,標本,應注意避免溶血 在5 天內測定的血清標本可放置于4℃、超過一周測定的需－20℃保存盡量避免反復凍

11、融（少量分裝）,2024/2/9,加樣和稀釋,加樣本的準確性（個人因素和實驗條件） 盡可能排除主關因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶） 各種試劑盒標本的稀釋使用，嚴格按照說明是操作,2024/2/9,溫育,溫度 水浴箱 發(fā)硬板應漂浮于水上或水面應高于反應板,2024/2/9,洗版,手洗 洗板機 （微孔液體殘留45s）,2024/2/9,顯色,通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應立即丟棄 先加A后加B，顯色時間嚴格按說

12、明書進行 終止后15內比色,2024/2/9,質控,室內質控血清 即刻法,2024/2/9,ELISA試劑的常見問題原因及其解決,顯色淺，靈敏度低 假陽性多，本底高甚至花板 重復性不好 白板,2024/2/9,顯色淺 靈敏度低,2024/2/9,,2024/2/9,假陽性多，本底高甚至花板,2024/2/9,,2024/2/9,重復性不好,2024/2/9,白板,2024/2/9,結果處理,OD值出現(xiàn)負值 陰性對照值