生物學的幾個階段

1、一、生物學的幾個發(fā)展階段簡要回顧,二、分子生物學的發(fā)展簡史,三、分子生物學的概念、原理、研究內容,四、分子生物學取得的主要理論成就,五、分子生物學取得的重要應用成就,六、分子生物學的主要技術進步七、遺傳的分子生物學八、基因工程,現(xiàn)代生物學進展,1、普通生物學階段：以個體、群體、博物、描述為特 征的生物學,,,2、細胞生物學階段：在細胞水平上揭示生命活動規(guī)律,

2、3、分子生物學階段：在生物大分子水平上研究生命活 動規(guī)律,,4、反向生物學階段: 由基因型到表型，由序列到功能 的，與傳統(tǒng)生物學研究思路反向 而行的生物學，從理論上探討生

3、 命的本質和生命運動的邏輯。,一、生物學的幾個發(fā)展階段,二、分子生物學發(fā)展簡史,1944. Avery證明DNA為遺傳物質（轉化試驗）1953. Waston&Crick DNA雙螺旋結構1958. Crick提出遺傳中心法則1961. Monas&Jacob 乳糖操縱子模型1966. Neriberg等 破譯全部遺傳密碼1970. Arber等 DNA限制性內切酶

4、 Khorana 體外合成tRNA，發(fā)現(xiàn)連接酶 Baltimore&Temin 逆轉錄酶,1972. Berg λ噬菌體與SV40DNA體外重組1973. Boyer&Cohen 重組質粒表達成功1975. Southern 發(fā)明雜交技術 Bishop等發(fā)現(xiàn)第一個癌基因Src1977. Sanger.Maxman&Gilbert 快速測序1978.

5、Miniatis 建立人類基因文庫1981. Cech&Altman 發(fā)現(xiàn)核酶1983. McClintock 發(fā)現(xiàn)的跳躍基因獲獎1984. Kohler 單克隆抗體技術1985. Mullis 首創(chuàng)PCR技術,1990. 人類基因組計劃正式啟動1993. Roberts&Sharp 發(fā)現(xiàn)斷裂基因 Smith進行基因的定點突變1994. Gilman&Bodbell G蛋白信號轉

6、導1995. Lewis等發(fā)現(xiàn)果蠅體節(jié)發(fā)育基因1997. Stanley 發(fā)現(xiàn)朊病毒1999. Gunter.Blobel 闡明胞內蛋白運輸機理2000. Carlsson等神經(jīng)多巴胺在信號轉導中的作用2001. Hartwell等發(fā)現(xiàn)細胞周期調控因子CDK激酶等,三、分子生物學概念、原理、內容,1、概念： 廣義：所有生物大分子的結構、功能、重要性、規(guī)律性及相互關系 狹義：分子遺傳學,2、內容：①生物大分子的結構與功能

7、 或 ①蛋白質的分子生物學②基因工程 ②核酸的分子生物學③基因表達調控 ③信號轉導的分子生物學,3、三條基本原理： ①所有生物體大分子的構成單位相同②大分子建成規(guī)則相同③生物體的特異性由其大分子的特異性所規(guī)定,四、主要的理論成就,1、DN

8、A雙螺旋模板學說2、遺傳中心法則3、基因表達調控理論 （操縱子模型）4、基因學說的豐富和發(fā)展 （基因現(xiàn)代概念的確立）5、基因突變理論6、基因作圖理論7、分子進化學說8、信號轉導學說,9、細胞周期調控理論10、癌變的分子機制11、通用遺傳密碼字典與 非通用遺傳密碼字典12、生物信息學13、基因組學與比較基因 組學14、“RNA世界”假說15、細胞衰老和程序化死

9、 亡機理,五、主要的應用成就,（1）已用基因工程的技術研制出了一批珍貴的基因工程藥物： ①人生長抑素 ②生產(chǎn)胰島素 ③生產(chǎn)生長激素 ④生產(chǎn)組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子 ⑤抗血友病因子Ⅳ ⑥制備乙型肝炎疫苗 ⑦生產(chǎn)多種細胞因子 ⑧制備基因工程抗體,1、在醫(yī)學

10、上的應用成就,,（2）基因診斷與基因治療 ① 疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異 性高，適應性強的特點，常用方法有核酸雜交、RFLP、 PCR、DNA指紋圖譜 ② 法醫(yī)診斷、親子鑒定 ③ 基因治療：方法有將目的基因與逆轉錄病毒重組、轉染 受體細胞，使之表達以彌補缺陷；將目的基

11、因對染色體 進行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,至1997年，美國已批準上市的基因工程藥物有近20種，它們是：胰島素、人生長激素、干擾素、白細胞介素2、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、組織溶纖原激活劑、生長激素、促生長素、抗血友病因子Ⅷ、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、體內用單克隆抗體、鼠單克隆抗體。 至1998年，我國已批

12、準上市的基因工程藥物亦有10余種，如：干擾素、白細胞介素、粒細胞集落刺激因子、鏈激酶、紅細胞生成素、成纖維細胞生長因子等。,基因工程方法生產(chǎn)蛋白質藥物的優(yōu)勢是非常明顯的,已投入使用（含臨床試驗）的基因工程疫苗,,①轉基因植物：已克隆了100多個植物基因，使作物獲得高 產(chǎn)、優(yōu)質、抗病、抗蟲、抗逆等多種優(yōu)良性狀，下表列出 了各國轉基因作物的大田釋放情況：,2、在農(nóng)業(yè)上的應用成就,我國獲準進入大田的轉基因植物（1998）,②轉基

13、因動物：相繼培育成功的轉基因動物包括，鼠、豬、 羊、雞、兔、鯉魚、鯰魚、金魚等。,③克隆動物：1997年，英國科學家克隆成功“多莉”綿羊 （由成年乳腺細胞發(fā)育而來）和“波莉”綿羊，它的乳汁 中含有人類基因的蛋白產(chǎn)物。,④分子輔助育種：改選育性狀為選育標記。,.,3、在能源開發(fā)和環(huán)保中的成就,①利用超級工程菌以植物秸桿作材料生產(chǎn)有 “綠色石油”之稱的新型能源——酒精。②構建超級工程菌迅速清除海洋中的石油污

14、 染及其它環(huán)境污染。,4、在采礦工業(yè)中的應用,用工程菌浸礦，浸出銅、鈾、鈷、錳、鋅、鋁等金屬加拿大用細菌浸出的鈾已達230萬噸。,,,①人類基因組計劃②水稻基因組計劃③模式生物基因組研究：已闡明基因組序列的生物有19種 （均為單細胞生物），此外小鼠、果蠅、家蠶、擬南芥等 模式生物的基因組序列也將很快闡明。④建立了世界共享的三大分子數(shù)據(jù)庫,5、基因組學的重大進展,六、技術進步,1.超離技術2.電泳技術3.電鏡

15、技術4.X衍射與核磁共振5.分子雜交技術(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文庫7.PCR,8.DNA測序9.DNA化學合成10.載體構建11.染色體步查12.基因定點誘變13.基因打靶14.基因轉移15.動物克隆,16.單克隆抗體17.基因工程抗體18.基因診斷19.基因治療20.基因作圖21.差異顯示22.分子進化工程,23.分子輔助育種24.生物芯

16、片25.DNA指紋26.酵母雙雜交27.基因捕獲28.RNAi29.基因敲除,ＰＣＲ法：PCR（polymerase chain reaction)技術是Mullis于1986年發(fā)明的一項體外快速大量擴增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎）。其基本原理就是在體外模擬體內DNA復制的過程，在反應系統(tǒng)中加入欲被擴增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應

17、時，先加熱至約92℃，使模板變性。降溫至約50℃使引物與模板結合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重復92℃（變性）、50℃（復性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴增，可以重復幾十個周期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應周期數(shù)）的倍數(shù)增加。,,人類基因組計劃1993-1998年的目標和截止到1998年10月全球定量完成的情況以及1998-2003年的新目標,七、生物信息學簡介,研究內容：,（1）各種生物

18、數(shù)據(jù)庫的建立和管理。這是一切生物信息學工作的基礎，通常要有計算機科學背景的專業(yè)人員與生物學家密切合作。（2）數(shù)據(jù)庫接口和檢索工具的研制。數(shù)據(jù)庫的內容來自萬千生物學者的日積月累，最終又為生物學者們所用。但不能要求一般生物學工作者具有高深的計算機和網(wǎng)絡知識，因此，必須發(fā)展查詢數(shù)據(jù)庫和向庫里提供數(shù)據(jù)的方便接口。這是專業(yè)人員才能勝任的工作，通常在生物信息中心里進行。,（3）人類基因組計劃的實施，配合大規(guī)模的DNA自動測序，對信息的采集和處理提

19、出了空前的要求。從各種圖譜的分析，大量序列片段的拼接組裝，尋找基因和預測結構與功能，到數(shù)據(jù)和研究結果的視像化，無不需要高效率的算法和程序。研究新算法、發(fā)展方便適用的程序，是生物信息學的日常任務。（4）生物信息學最重要的任務，是從海量數(shù)據(jù)中提取新知識。這首先是從DNA序列中識別編碼蛋白質的基因，以及調控基因表達的各種信號。其次，從基因組編碼序列翻譯出的蛋白質序列的數(shù)目急劇增加，根本不可能用實驗方法一一確定它們的結構和功能。從已經(jīng)積累的數(shù)

20、據(jù)和知識出發(fā)，預測蛋白質的結構和功能，成為常規(guī)的研究任務。（5）DNA芯片和微陣列的發(fā)展，把一定組織或生物體內萬千基因時空表達的研究提上日程．研究基因表達過程中的聚群關系，從中提取調控網(wǎng)絡和代謝途徑的知識，進而從整體上模擬細胞內的全部互相輔合的生化反應，在亞細胞層次理解生命活動。只有掌握已有數(shù)據(jù)、發(fā)展嶄新算法，才能創(chuàng)造新的知識。這是生物信息學剛剛掀開的新篇章。,2、在基因組計劃中的作用1）高度自動化的實驗數(shù)據(jù)的獲得、 加

21、工和整理2）序列片段的拼接3）基因區(qū)域的預測4）基因功能預測5）分子進化的研究,遺傳的分子生物學,基因的化學基礎是什么？遺傳的染色體理論認為：基因位于細胞核內染色體上；染色體的主要化學成份——蛋白質和核酸何者為基因的化學基礎？*“蛋白質是遺傳物質”觀點及其主要論據(jù)?；蚧瘜W本質的條件：具有三種功能(p31)。遺傳功能(復制與世代傳遞)；表型功能(具有適當?shù)目刂菩誀畹谋磉_機制)；進化功能(能夠產(chǎn)生變異滿足生物進化的要

22、求)。,三個學派,E. Schrödinger(1945)(薛丁格)：What is life?二十世紀，由于物理學、化學和數(shù)學研究工作者的加入，在生物學與遺傳學研究領域形成了三個學派：物理學——結構——結構學派；化　學——生化——生化學派；數(shù)　學——信息——信息學派。,第一節(jié) DNA作為主要遺傳物質的證據(jù),一、 DNA是遺傳物質的間接證據(jù)二、 DNA是遺傳物質的直接證據(jù)(一)、 細菌轉化試驗(二)、 噬菌體侵染

23、與繁殖試驗(三)、 煙草花葉病毒拆合實驗*三、非核酸類的遺傳物質,,一、 DNA是遺傳物質的間接證據(jù),1. DNA含量的恒定性；2. DNA代謝的穩(wěn)定性；3. 基因突變與紫外線誘變波長的關系。,,(二)、 噬菌體侵染與繁殖試驗,1. 背景知識噬菌體侵染與繁殖基本過程：T2噬菌體浸染大腸桿菌后，遺傳物質進入細菌細胞；利用大腸桿菌的遺傳復制系統(tǒng)復制噬菌體遺傳物質；利用大腸桿菌的遺傳信息表達系統(tǒng)合成噬菌體組件；最后組

24、裝形成完整的T2噬菌體。因此只要弄清侵染時進入細菌的是噬菌體的哪一部分，就可能證明哪種物質是遺傳信息的載體。另外：P是DNA的組成部分，但不存在于蛋白質中；S存在于蛋白質中，但DNA中沒有。,2. Hershey和Chase的實驗(p33),結果與結論,試驗結果表明：主要是由于DNA進入細胞內才產(chǎn)生完整的噬菌體；結論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質。題外話：與Avery等人研究比較，本試驗的精度低得多。但是由于放射性

25、標記法(也稱為示蹤原子法)，當時為人們普遍采用；同時由于核酸研究及其它相關的成果，本試驗結果很快得到人們的廣泛認同。,,(三)、 煙草花葉病毒拆合試驗,煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質構成的管狀微粒：中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質外殼。1. 拆分感染試驗：將TMV的RNA與蛋白質分離、提純；分別接種煙葉，發(fā)現(xiàn)RNA能使煙葉致病，而蛋白質不能；用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺

26、傳物質。,2. 重組合試驗,Frankel-Conrat, Singer (1956)進行了圖示試驗：綜上所述：到上世紀中期，多方面證據(jù)都直接或間接地表明DNA是主要的遺傳物質，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質。,,第二節(jié) 核酸的化學結構與DNA復制,*一、早期對核酸化學性質的研究二、DNA的一級結構三、DNA的二級結構*四、RNA的分子結構*五、DNA的復制,,*一、早期對核酸化學性質的研究,雖然上世紀中才認識

27、到DNA的生物學功能，核酸研究卻已有一百多年歷史：F.Mischer(1869)從外科繃帶上膿細胞核中分離出一種不同于蛋白質的物質，含磷量高、并具有很強的酸性。他將這種物質稱核質(素)(nuclein)；A.Kossel(1879)發(fā)現(xiàn)酵母等核質具有A、G、T、C四種堿基；R.Altamm(1889)將核素命名為核酸(nucleic acid)。,Kossel(1901)又發(fā)現(xiàn)核酸中具有碳水化合物(糖)；P.A.T.Levene

28、(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖——核糖；Fisher(1914)人工合成核苷酸；P.A.T.Levene(1929)又發(fā)現(xiàn)動物胸腺細胞核酸含有脫氧核糖.Levene將前者命名為核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，后者命名為脫氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid, DNA)。并指出動、植物中均存在這兩種核酸。,,二、 核酸的一級結構,關于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結構等內容是生物

29、化學中討論的內容，請課后復習。在此談三個關于核酸一級結構的內容：(一)、 “四核苷酸”假說；(二)、 查伽夫定則及其意義；*(三)、 核苷酸序列及其測定。,(一)、 “四核苷酸”假說,P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假說，認為：核苷酸是核酸的基本組成單位；核酸是“磷酸—核糖(堿基)—磷酸”的核苷多聚體。四核苷酸假說奠定了核酸化學基礎。但同時認為：核酸多聚體是由“四核苷酸結構”重復形成；每個四核苷

30、酸結構包含四種堿基各一個；所以事實上認為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結構的簡單重復。這種觀念影響了人們對核酸生物學功能的進一步認識。,(二)、 查伽夫定則及其意義,E.Chargaff于1946-1950年根據(jù)紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗結果提出查伽夫定則：四種堿基的數(shù)量不是等量的；同一物種DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同；嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)

31、，且A=T、G=C。,*(三)、 核苷酸序列及其測定,查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結構的簡單重復，核酸的堿基序列信息可能具有重要意義。以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學功能的基礎，是遺傳信息的內在形式。DNA及RNA分子序列分析技術也是最重要的分子遺傳學研究技術：Sanger雙脫氧法；Maxam&Gillbert化學法；基于化學法的DNA序列自動分析儀已成為常規(guī)實驗設備。,,三、DNA的二級結構,*(一)、D

32、NA分子結構的研究1. 鮑林研究小組2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組3. 沃生、克里克研究小組(二)、 DNA分子雙螺旋結構模型1. DNA分子雙螺旋結構模型要點2. DNA雙螺旋結構模型的意義3. DNA分子構型的多態(tài)性,,*(一)、DNA分子結構的研究,在“四核苷酸結構”理論的誤導下，人們普遍認為核酸的組成、結構簡單，可能不具有重要功能，一度忽略了對核酸的研究。上世紀中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然DN

33、A的結構研究是進一步研究其功能和作用方式的基礎。也由此激發(fā)了科學家從事核酸結構研究的興趣，當時進行DNA結構研究的科學家很多，最重要有：,1. 鮑林研究小組,主要工作：鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質α-螺旋模型后)開始研究DNA分子結構。根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結構)進行研究。提出DNA分子三鏈螺旋結構模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。

34、評價：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結構模型研究確立了方向。注：1954年鮑林因研究物質聚合力而獲得諾貝爾化學獎。,2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組,主要工作成就：Wilkins和Franklin改進了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結果表明：堿基位于螺旋內側而磷酸基團在外側，同時測得了DNA螺旋的直徑和螺距。,3. 沃生、克里克研究小組,Wa

35、ston、Crick(1951-1953)：研究手段非常簡單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結構。理論知識深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。,3. 沃生、克里克研究小組,主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個DNA雙螺旋結構模型?，F(xiàn)在人們公認這是分子遺傳學建立的標志。為此Waston，Crick

36、和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學及醫(yī)學獎。,,1. DNA分子雙螺旋結構模型要點,,2. DNA雙螺旋結構模型的意義,DNA雙螺旋模型結構同時表明：DNA復制的明顯方式——半保留復制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按堿基互補配對原則進行半保留復制。而在此之前對復制方式人們對一無所知?；蚝投嚯某删€性對應的一個可能的理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基

37、序列；并存在某種遺傳密碼(genetic code)，將核苷酸序列譯成蛋白質氨基酸順序。在其后的幾十年中，科學家們沿著這兩條途徑前進，探明了DNA復制、遺傳信息表達與中心法則等內容。,,3. DNA分子構型的多態(tài)性,,*四、RNA的分子結構,,*五、DNA的復制,DNA復制的起點(單起始點與多起始點)；復制的方向(單向與雙向)；復制的拓撲學；鏈的延伸(半不連續(xù))；復制的終止；單鏈環(huán)狀DNA的復制；復制的忠實性(準確性)；

38、復制的酶學；復制的調控。,半保留復制,復制叉的結構,,*第三節(jié) 遺傳信息的表達與調控,一、中心法則及其發(fā)展二、遺傳信息的轉錄(RNA的合成)　　 與RNA的加工三、遺傳密碼及其特性四、遺傳信息的翻譯五、基因表達調控,,一、中心法則及其發(fā)展,中心法則(central dogma)闡述生物世代、個體以及從遺傳物質到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質復制、性狀表現(xiàn)過程中的信息流向。最初由Crick提出，并經(jīng)過了多次修正。

39、,中心法則的發(fā)展,反轉錄(逆轉錄)：反轉錄酶；cDNA。RNA的自我復制。DNA指導蛋白質合成。,,三、遺傳密碼及其特性,遺傳密碼的基本特性：三聯(lián)性；非重疊性；連續(xù)性；簡并性；有序性；通用性。,三、遺傳密碼及其特性,起始密碼子與終止密碼子：起始密碼子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；終止密碼子(無義密碼子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。通用性的另外情況：,,第四節(jié) 基因的概念與發(fā)展,一

40、、經(jīng)典遺傳學中基因的概念二、生化遺傳和早期分子遺傳學　　對基因概念的發(fā)展三、基因的微細結構與性質四、現(xiàn)代分子遺傳學關于基因的概念,,二、 生化遺傳學對基因概念的發(fā)展,生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個重要方面發(fā)展了基因的概念：基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段，并且在染色體上位置固定、序列連續(xù)；遺傳信息就存在于核苷酸(堿基)序列中?！耙粋€基因一個酶”，基因表達為蛋白質；基因的核苷酸序列決定蛋白質氨基酸序列。,,

41、T4突變型(rII)遺傳研究,Seymour Benzer(1955)用E. Coli烈性噬菌體T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說法是不正確的。T4野生型在E. Coli菌苔上產(chǎn)生小而不規(guī)則噬菌斑。T4突變品系按表型可分為：rI、rII、rIII三類。其中rII在E.Coli B上產(chǎn)生快速溶菌現(xiàn)象，形成大而圓噬菌斑，在E.Coli K(λ)上不能生長。,試驗方法與結果,試驗方法：最初得到8個不同的rⅡ突變型品系，8個突變基因均

42、定位于T4DNA的一個區(qū)段內(rII區(qū)段)；將8種突變型兩兩組合混和感染E. Coli B菌株(雙重感染, double infection)；從混和培養(yǎng)物中提取噬菌體顆粒感染E. coli K(λ)。試驗結果：在菌苔上獲得了許多小而粗糙的野生型噬菌斑。,雙重感染試驗,野生型的產(chǎn)生與基因內重組,結果分析：回復突變的頻率很小，不會產(chǎn)生如此高頻率的野生型噬菌體(斑)；所以野生型只能由重組產(chǎn)生。用擬等位基因可以解釋試驗結果；但同時

43、意味著：rII區(qū)段內至少存在8個擬等位基因。Benzer先后分離到400多個不同的rII突變。在rII區(qū)段內存在如此多的基因顯然是不可能的。結論：這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是rII區(qū)段突變形成的復等位基因?；蚴怯筛〉闹亟M單位構成，野生型產(chǎn)生于基因內重組，從而推翻了經(jīng)典遺傳學基因不可分性的性質。,*雙重感染法繪制rII區(qū)段連鎖圖,操作方法：用兩種rII突變型雙重感染B品系，收集溶菌液；分別接種到B品系、K(λ)品

44、系菌苔上；考察兩個品系菌苔上的噬菌斑數(shù)目，就可以計算兩個突變位點間的重組值；繪制連鎖遺傳圖。由于采用了條件致死選擇系統(tǒng)(即在E. Coli K(λ)上rII不能生長)，分辨率極高，可以檢測到十萬分之一的重組值。,B品系雙重感染的結果,3. 最小的結構單位,重組值檢測精度可達十萬分之一，但實際結果不會低于0.01%；可推斷基因內存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為重組子(recon)。rII區(qū)段存在多種突變的結構表明：基因

45、也并非最小突變單位。Benzer提出用突變子(muton)來描述基因突變的最小單位。理論上講突變子不必等于重組子。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個核苷酸對或者堿基對(bp)。所以基因內每個堿基均可能發(fā)生突變，任意兩個堿基間均能發(fā)生交換重組。,,1. 雙突變雜合體的互補作用,假定有兩個獨立起源的隱性突變，具有類似的表型，如何判定是屬于同一基因(功能單位)的突變還是分別屬于兩個基因(功能單位)的突變呢？在二倍體生物中，可以建立雙突

46、變雜合體。雙突變體雜合體有兩種形式，即順式(cis)和反式(trans)，如圖所示：,順反測驗與順反子,根據(jù)兩突變反式雙雜合體有無互補作用可以判斷它們是否為同一個功能單位的突變：突變型?無互補作用?為同一功能單位的突變；野生型?有互補作用?為不同功能單位的突變。這種測驗稱為互補測驗，也稱為順反測驗(cis-trans test)。Benzer將順反測驗所確定的最小遺傳功能單位稱為順反子(cistron)，順反子內發(fā)生的突變間不能互

47、補。,rII順反測驗,rII區(qū)段突變的性質：rII突變具有共同性狀，按經(jīng)典遺傳學理論，rII區(qū)段為一個基因；如果基因是最小的功能單位，它也是一個順反子。Benzer通過順反測驗表明：100多個rII突變型可以分為A、B兩組，組間突變型間能夠突變，而組內的突變型間不能互補；與rII區(qū)段連鎖圖對照發(fā)現(xiàn)：兩組突變分別位于rII區(qū)段的兩端| A | B |。,rII的兩個順反子,經(jīng)典遺傳學意義

48、上的一個基因(rII區(qū)段)實際上有兩個順反子(功能單位)。因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。有些基因具有一個順反子，有些基因具有多個順反子。在多順反子情況下，基因是幾個功能單位的復合體。Benzer提出“一個順反子一條多肽鏈”。,,四、 現(xiàn)代分子遺傳學關于基因的概念,(一)、 現(xiàn)代基因概念基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段?；蛴芍亟M子、突變子序列構成的。重組子是DNA重組的最小可交換單位；突變子是

49、產(chǎn)生突變的最小單位；重組子和突變子都是一個核苷酸對或堿基對(bp)?；蚩梢园鄠€功能單位(順反子)。,(二)、 基因的功能類型,根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為：1. 編碼蛋白質的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。如結構蛋白、酶等結構基因和產(chǎn)生調節(jié)蛋白的調節(jié)基因。2. 沒有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質的基因。轉錄產(chǎn)物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。3. 不轉錄的DNA區(qū)段。如啟動基因、操縱基因。啟動基因是轉錄時RNA多聚酶

50、與DNA結合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結合的部位。,(三)、 基因的幾種特殊形式,1. 重復基因：指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復基因往往是生命活動中最基本、最重要的功能相關的基因。最典型的重復基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。2. 重疊基因：同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉錄范圍)不同，同時成為兩個或兩個以上基因的組成部分。因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個基因完全存在于另一個基因內部

51、。,3. 斷裂基因或隔裂基因,生物遺傳和早期分子遺傳認為基因是一個連續(xù)的、完整的結構。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中間存在不表達的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。外顯子：參加蛋白質編碼的DNA片段；內含子：不參加蛋白質編碼的DNA片段。真核生物基因可能是不同外顯子的組合——斷裂基因。,4. 跳躍基因(jumping gene),又稱為轉座子(transposon)、轉座因子、轉位因子(transpo

52、sable element)。生化遺傳和早期分子遺傳學還認為基因在染色體上的相對位置是固定的。后來發(fā)現(xiàn)某些DNA序列可以在染色體上轉變位置。轉座子轉位的過程也是一個遺傳重組過程；轉座子在染色體上轉位可能會引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉位離開插入點時便會發(fā)生基因功能的恢復。,,第五節(jié) 基因突變的分子機制,一、locus與site二、基因突變的類型三、DNA的防護機制四、DNA修復與突變的產(chǎn)生五、化學因素誘變的分子機

53、制,,一、locus與site,經(jīng)典遺傳學認為：基因是染色體上的一個點，稱位點(site)?，F(xiàn)代基因概念認為：基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段；基因是由眾多堿基對構成，此時將一個堿基對稱為基因的一個位點(site)；而將基因在染色體上的位置則稱為座位(locus)。,,二、 基因突變的類型,1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為：形態(tài)突變型；生化突變型；致死突變型；條件致死突變型。2. 根據(jù)基因結構的改變方式：

54、堿基替換突變；堿基倒位；移碼(插入與缺失)突變。,二、 基因突變的類型,3. 從DNA堿基序列改變的多少：單點突變(替換)；與經(jīng)典遺傳學的點突變point mutation比較.多點突變(移碼)。4. 從突變所引起的遺傳信息意義的改變：同義突變；錯義突變；無義突變。,,第六節(jié) 遺傳工程,一、 遺傳工程概述*二、 染色體工程*三、 細胞工程四、 基因工程,,一、 遺傳工程概述,遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本

55、規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質基礎。在此基礎上：解釋、研究生物進化的原因、過程和規(guī)律(遺傳與進化)。改善動、植物和微生物的遺傳特性——按照人類的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類型、新品種的人工進化過程(育種學)。育種工作的理論和技術水平在很大程度上取決于遺傳學所取得的成就。訖今為止，動、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎所取得的。六、七十年代的綠色革命；育種工作面臨的問題。,一、 遺傳工程概述

56、,(一)、 遺傳工程的基礎人類對自然改造的能力取決于對自然規(guī)律的認識水平。分子遺傳、生物化學及分子生物學、細胞生物學的理論和技術發(fā)展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高。遺傳工程的理論與技術基礎主要來自于：1. 分子遺傳學的理論；2. 生物化學及分子生物學的成就；3. 細胞生物學理論和技術。,(二)、 遺傳工程的含義,生物技術生物工程：遺傳工程；蛋白質工程、酶工程；微生物工程；……遺傳工程：在分子遺傳理論、技術的

57、基礎上，通過工程設計與施工方式，從細胞、分子水平改造生物遺傳特性。,作為一個綜合性的技術群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關的組成部分，其主要的部分有三個：1. 染色體工程；2. 細胞工程；3. 基因工程。狹義的遺傳工程指的是基因工程。,,*三、細胞工程,細胞工程的主要技術和研究領域包括：細胞、原生質體的分離、培養(yǎng)；細胞、原生質體植株再生；體細胞無性系變異的誘導、篩選與應用；以細胞、原生質體作為基因工程受體；細胞、

58、原生質體融合、雜種細胞篩選、鑒定與應用。,,(一)、細胞、原生質體植株再生,采用體細胞雜交在物種間進行遺傳轉移與應用的必要條件是：細胞、原生質體遺傳全能性能充分實現(xiàn)，再生成新的生物個體。對植物而言，細胞和原生質體再生技術已經(jīng)比較成熟。曾經(jīng)是人們公認難題的禾本科植物原生質體再生在近二十多年來也已取得巨大進展。對動物而言，克隆羊“多利”的誕生表明：動物細胞(包括人體細胞)再生成為個體都是可能，其技術實現(xiàn)需要的僅僅是時間。,,(二)、植

59、物原生質體作為基因工程的受體,最初常用的轉基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。在這些組織、器官中：細胞壁的存在會增加操作的難度；產(chǎn)生細胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選轉化子。因此原生質體是最具潛力的植物基因工程受體，轉化效率高、篩選方便。,,(三)、細胞、原生質體融合,采用細胞、原生質體融合產(chǎn)生雜種細胞，通過誘導再生獲得雜種個體(雙二倍體)，可避免有性雜交障礙。動物細胞不具有細胞壁，細胞融合技術較植物成熟和成功。當然動物細胞

60、融合都局限于獲得雜種細胞及其無性細胞系?？梢灶A見：用雜種細胞核代替維爾·穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細胞核可以獲得物種間雜種生物個體。人與小鼠雜種細胞的無性細胞系曾在人類基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。植物細胞融合由于細胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細胞壁分離原生質體的技術是植物細胞雜交的基礎。獲得雜種細胞及其再生植株后，即可進行物種間細胞核、染色體以及細胞器的轉移。,,基因工程,所謂的遺傳工程就是在分子水平上

61、，用人工方法提取（或合成）不同生物的遺傳物質，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細胞，使外源ＤＮＡ在受體細胞中進行復制和表達。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。所以基因工程（gene engineering）也稱為遺傳工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、ＤＮＡ重組技術（recombination DNA

62、techniques）。有時人們還稱它為基因克?。╣ene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。 遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細胞，克隆轉化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。,第一節(jié) 基因工程的酶學基礎一、限制性核酸內切酸（restriction endonuclease）：這類酶又簡稱為限制性內切酶或限制酶（ restricti

63、on enzyme）。限制性內切酶本來是微生物細胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。根據(jù)酶的功能、大小和反應條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內切酶分為三類：,Ⅰ型酶：分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，所以在基因工程中應用不大。Ⅱ型酶：分子量較?。?05Da），反應只需Mg++

64、的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ型酶：這類酶可識別特定順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。,同裂酶（isoschizomers)： 指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。同裂酶進行同樣

65、的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）： 指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。,限制性核酸內切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株

66、發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoR I: 來自于Escheria coli RY13的第一個限制酶。,二、末端轉移酶（terminal transferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉移酶常用于在平頭ＤＮ

67、Ａ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。,,平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內切酶酶

68、切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。,,,,,,,,,,Hpa II Hpa II,BamH I 或Sau3A,三、ＤＮＡ連接酶（DNA ligase） 該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。 DNA連接酶對具有粘性末端

69、的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。,,四、反轉錄酶（reverse transcriptase） 這類酶來自于反轉錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉錄酶兩種。五、DNA pol I及Klenow片段 該酶常用于制備放射性比度比活體標記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（n