單抗的發(fā)展與應用

1、© 2006 Accenture. All rights reserved.,1,Monoclonal antibody technology,© 2006 Accenture. All rights reserved.,2,輕鏈（L）由約214個amino acid組成，分兩種：Kappa（κ）和Lambda（λ），重鏈由450-550個amino acid組成，根據(jù)其抗原性差異可分為5種：μ鏈、γ鏈、α鏈、δ鏈和

2、ε鏈。由此將免疫球蛋白分為M、G、A、D和E。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,3,1 抗體技術的發(fā)展,單克隆抗體技術的發(fā)展第1代單抗技術：鼠源性單克隆抗體第2代單抗技術：嵌合性單克隆抗體第3代單抗技術：人源化單克隆抗體第4代單抗技術：全人源化單克隆抗體,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,4,1 細胞工程單克隆

3、抗體,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,5,2 單鏈抗體（scFv）,SOE法構建scFv基因產(chǎn)物,,,,,,,,,,,,,,,,VH,VL,VL,VH,變性、復性,接頭DNA，（Gly4Ser）3,引物,引物,,,接頭DNA,PCR,重疊延伸拼接法（SOE），是把Linker 的編碼序列分別設計在擴增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。 scFv的優(yōu)點

4、是分子量小、免疫原性弱、滲透力強，并具有藥物導向、中和毒素等功能，不需要進行糖基化修飾，可以在原核表達系統(tǒng)中進行表達。缺點是無抗體C區(qū)，不能介導抗體的其他生物學活性。,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,6,3 Fab抗體,Fab抗體分子的制備,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Pr,VH,VH,VL,CL,CH1,CH1,VL,CL,S-S-,,H鏈表達載體,L鏈表達載體,

5、共轉染細胞,,,,,,,,,,抗體分泌細胞,Fab片段是由H鏈Fd段和完整L鏈通過二硫鍵形成的異二聚體，僅含有一個抗原結合位點，大小為完整抗體的1/3?？衫檬删w構建表達有天然構象的Fab片段。 Fab片段有中和毒素和病毒，封閉受體和藥物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗體短的多。,Pr,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,7,4 抗體庫技術,抗體庫按基因的

6、來源可分為：鼠源性抗體庫，人源性抗體庫和駝源性抗體庫 抗體庫展示技術：噬菌體表面展示技術，酵母表面展示技術，核糖體展示技術,抗體庫技術的優(yōu)點：1 不需要進行細胞融合，避免了因雜交瘤不穩(wěn)定而需要反復亞克隆的繁瑣程序。2 擴大了篩選容量，可達到106以上的克隆，而雜交瘤技術一般只能篩選約1000個克隆。3 可直接克隆到抗體的基因，便于進一步構建各種基因工程抗體。4 得到的抗體可以進行原核表達，降低制備成本。5 構建抗體庫時由于

7、H鏈和L鏈V區(qū)基因在體外隨機組合，因而可以獲得新的特異性抗體。已有的噬菌體抗體庫：抗HIV，麻疹病毒，破傷風類毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，單純皰疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗體庫。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,8,構建方法1 動物免疫2 血清效價檢測3 淋巴細胞的分離純化4 總RNA提取5 第一鏈cDNA反轉錄合成6 輕、重鏈基因的擴增7 scFv DNA

8、的組裝與擴增8 scFv DNA片段的Sfi I/Not I 酶切9 pCANTAB5E –scFv 重組質粒的構建10 重組噬菌體的制備11 庫容量的滴定12 單鏈抗體噬菌體抗體庫的富集淘選,4.1 噬菌體展示技術構建和篩選scFv,圖片來源：蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,9,4.2 噬菌體展示技術構建和篩選Fab抗體,構建方法淋巴細

9、胞分離、總RNA提取及cDNA的合成與scFv抗體庫的構建相同1 PCR擴增Fd及輕鏈基因2 PCR擴增產(chǎn)物的純化3 輕鏈基因的克隆4 重鏈Fd基因的克隆及噬菌體抗體庫的建立和鑒定5 Fd基因的克隆及抗體庫的建立6 抗體庫的富集和篩選,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,10,4.3 酵母表面展示技術,酵母表面展示技術是繼噬菌體展示技術之后發(fā)展起來的真核展示系統(tǒng)，不僅能

10、篩選噬菌體抗體庫的全部抗體，而且能篩選新型抗體，是噬菌體抗體庫篩選抗體的兩倍。 酵母存在MATa和MATα 2種交配型單倍體細胞。酵母表面展示技術有兩種：a凝集素展示系統(tǒng)是將目的蛋白的C端與a凝集素的Aga2亞基的N端融合；α凝集素展示系統(tǒng)是將目的蛋白的N端與α凝集素的C端融合。,α 凝激素展示系統(tǒng)原理圖,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,11,5 特殊基因工程抗體,1.

11、7.1 雙特異性抗體BsAb,圖片來源：武漢友芝友生物制藥有限公司,利用基因重組和抗體工程技術，由大容量抗體庫的構建及優(yōu)化系統(tǒng)，高通量抗體篩選系統(tǒng)，體內(nèi)體外抗體驗證系統(tǒng)三大部分組成，制備高效的腫瘤治療性抗體，對乳腺癌，淋巴瘤和結腸癌進行針對性的治療。,細胞工程BsAb將2株分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞融合得到四源雜交瘤，就可以同時分泌具有兩種親代單克隆抗體結合特性的BsAb。其合成、組裝與分泌過程和天然免疫球蛋白的產(chǎn)生過程相同，穩(wěn)定

12、性及藥代動力學特征也與天然抗體相似。,,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,12,6 人鼠嵌合單克隆抗體,為了消除人抗鼠抗體（HAMA）反應，使單抗更好的用于疾病治療，人們設計了嵌合抗體。在基因水平上將鼠源單克隆抗體的V區(qū)和人抗體的C區(qū)連接起來，并在合適的宿主細胞中表達的抗體，成為人-鼠嵌合抗體。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Pr,鼠VL,人CL,人CH,,免疫球蛋白基

13、因載體的構建,L鏈嵌合載體,共轉染細胞,,,,,,,,,,抗體分泌細胞,Pr,鼠VH,H鏈嵌合載體,,,,,,,,,嵌合抗體的構建,已上市銷售的人鼠嵌合抗體：Rituximab CD20 抗腫瘤、類風濕Cetuximab EGFR antagonist 抗腫瘤Clotinab,abciximab

14、 GPⅡb Ⅲa receptor 抗凝，心血管 antagonistInfliximab TNF-α antagonist 類風濕，克隆氏病等Basiliximab IL-2 receptor antagonist 抗移植排斥,,,,,,© 2006 Accenture

15、. All rights reserved.,13,全人源化單抗 人源化技術的難點在于它需要大量的學科集成，非常復雜，因為任何氨基酸改變都會影響蛋白質結構、活性，而這方面又沒有太多規(guī)范可以遵循，因此需要大量的實踐和探索。這是單抗藥物研發(fā)的核心技術 ，也是未來的發(fā)展方向。兩個難點：一是抗體人源化技術，二是哺乳動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)。 已上市的人源單抗：Panitumumab EGFR antagonist

16、 直腸癌Adalimumab TNF antagonist 類風濕，克隆氏病等Ustekinumab IL-12,IL-23 antagonist 銀屑病,7 全人源化單克隆抗體,全人源化單抗的兩條技術路線：轉基因小鼠技術，噬菌體展示技術,,© 2006 Accenture. All rights reserved.,14,轉基因小鼠技術

17、 目前主要是人外周血淋巴細胞-嚴重聯(lián)合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）轉基因小鼠和轉染色體小鼠制備人抗體技術。,hu-PBL-SCID轉基因小鼠將已產(chǎn)生一定免疫反應的供者或癌癥患者的淋巴細胞導入嚴重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠，作為暫時的人免疫系統(tǒng)發(fā)揮有限的功能。然后取鼠的脾細胞與人骨髓瘤細胞雜交就可以獲得分泌人抗體的雜交瘤細胞,轉染色體小鼠通過基因敲出技術使小鼠

18、自身基因失活并導入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體H、L鏈基因簇而自身抗體基因失活的轉基因小鼠。此種小鼠所攜帶的人DNA片段具有完備的功能，可以有效的進行同種型轉換和親和力成熟。,,,親和力成熟：在抗原刺激下，抗體V區(qū)發(fā)生高頻突變，具有高親和力抗體的細胞群體獲得優(yōu)勢而進一步擴增，同時經(jīng)過類別轉換，即不再表達μ鏈、 δ鏈，而表達γ、α或ε而成熟。,© 2006 Accenture. All rights reserved.,15,2 抗

19、體的市場和應用,單抗從最初的鼠源單抗過渡至人源化單抗直到現(xiàn)在的全人單抗,單克隆抗體的發(fā)展使抗體制備技術進入了一個全新的時代, 其相關的藥物已廣泛應用到生物醫(yī)學中的許多領域, 如腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植、戒毒、血液性疾病、感染性疾病、中毒性疾病、變態(tài)反應性疾病等方面的診斷和治療。 目前美國和歐盟已批準上市抗體藥物34個，全球有近300家公司正在研究抗體藥物，其中，臨床研究抗體項目有100多個，在研項目超過300個。我國已批

20、準上市抗體藥物18種，其中進口10種，國內(nèi)企業(yè)獲得抗體新藥證書8個，實現(xiàn)銷售4種，臨床研究抗體藥物13種。 （截止到2012.12）,2011年全球抗體藥物的市場規(guī)模為671億美元。預計到2020年,生物技術藥物占全部藥品銷售收入的比重將超過1/3。 據(jù)全球醫(yī)藥市場預測機構EvaluatePharma對2012年銷售前15位藥品的估計,今年生物技術產(chǎn)品全面崛起,其中銷售前十強中,單克隆抗體藥物占據(jù)五席。,,,©

21、2006 Accenture. All rights reserved.,16,國內(nèi)主要抗體公司成都華神集團股份有限公司制藥廠華蘭生物工程股份有限公司上海蘭生股份有限公司北京天壇生物制品股份有限公司上海中信國建藥業(yè)股份有限公司百泰生物藥業(yè)有限公司北京天廣實生物技術有限公司大連亞維藥業(yè)有限公司美恩生物技術有限公司武漢生物制品研究所上海張江生物技術有限公司上海亞聯(lián)抗體醫(yī)藥有限公司,國外主要抗體藥物公司瑞士羅氏公司