新藥研究與開發(fā)青蒿素

1、青蒿素片的研發(fā)過程,姓名：XXX 學(xué)號：........... 專業(yè)：@@@@@@@@@@@@@,,,,,2024/3/2,Contents,一、研究歷史,青蒿素的故事原來始于中國文化大革命和援越抗美戰(zhàn)爭時期。當(dāng)年在越南戰(zhàn)爭的戰(zhàn)場上，由于瘧疾的流行，作戰(zhàn)雙方的士兵紛紛感染瘧疾，嚴(yán)重地影響了部隊?wèi)?zhàn)斗力?？孤揉膼盒辕懺x (Plasmodium falciparum) 的出現(xiàn)更成為當(dāng)時瘧疾防治的主要難題.

2、 1967年5月23日，在毛澤東主席和周恩來總理的指示下，一項具有國家機密性質(zhì)、代號為“523項目”的計劃就此啟動了。項目短期的目標(biāo)是要盡快研制出能在戰(zhàn)場上有效控制瘧疾的藥物 ，而它的長遠(yuǎn)目標(biāo)是通過篩選合成化合物和中草藥藥方與民間療法來研發(fā)出新的抗瘧藥物。 1969年1月，屠呦呦被任命為北京中藥研究所523課題組的組長,領(lǐng)導(dǎo)對傳統(tǒng)中醫(yī)藥文獻和配方的搜尋與整理。,,歷經(jīng)380多次鼠瘧篩選，1971年10月取得中藥青蒿

3、素篩選的成功。1972年從中藥青蒿素中分離得到抗瘧有效單體，命名為青蒿素，對鼠瘧、猴瘧的原蟲抑制率達到100%。 1973年經(jīng)臨床研究取得與實驗室一致的結(jié)果，抗黃花蒿瘧新藥青蒿素由此誕生。 1981年10月在北京召開的由世界衛(wèi)生組織主辦的“青蒿素”國際會議上，中國《青蒿素的化學(xué)研究》的發(fā)言，引起與會代表極大的興趣，并認(rèn)為“這一新的發(fā)現(xiàn)更重要的意義是在于將為進一步設(shè)計合成新藥指出方向”。 1

4、986年，青蒿素獲得新一類新藥證書，雙氫青蒿素也獲一類新藥證書。這些成果分別獲得國家發(fā)明獎和全國十大科技成就獎。 2011年9月23日，青蒿素的研究者屠呦呦獲得美國紐約拉斯克獎，這是中國科學(xué)家首次獲得這一國際醫(yī)學(xué)大獎。 2011年11月15日，中國中醫(yī)科學(xué)院在京舉行“2011年科技工作大會”。會上授予屠呦呦中國中醫(yī)科學(xué)院杰出貢獻獎，獎勵青蒿素研究團隊100萬元人民幣。 2012年7月4日，

5、上海交通大學(xué)宣布，在世界上首次實現(xiàn)了抗瘧藥物——青蒿素的常規(guī)人工化學(xué)合成。,二、實驗方案,方法一、CO2超臨界流體萃取法 實驗步驟： 1、粉碎-裝料：將黃花蒿粉碎成中粉，裝入料筒中，在整體裝入萃取釜中。 2、CO2超臨界流體萃?。篊O2經(jīng)熱交換器冷卻進入貯罐；冷CO2經(jīng)壓縮機壓縮至20MPa，再經(jīng)熱交換器加熱至50℃進入萃取釜中；兩萃取釜間歇交替工作，每個萃取釜萃取4個小時后切換，

6、保證萃取液連續(xù)從萃取釜中抽出；萃取液先通過過濾器除去可能夾帶出的固體顆粒，然后經(jīng)熱交換器加熱至60℃，進入一級分離釜，萃取液析出部分雜質(zhì)后進入另一熱交換器，調(diào)節(jié)溫度至所需值，再進入二級分離釜析出青蒿素等溶質(zhì)。分離釜采用兩組并聯(lián)，當(dāng)一組解析溶質(zhì)時，另一組放空取出提取物。 3、硅膠柱凈化：從二級分離釜出來的CO2帶有少量的溶質(zhì)和水分，經(jīng)熱交換器將溫度調(diào)至預(yù)設(shè)值后進入硅膠柱。硅膠柱采用兩柱并聯(lián)操作，一個硅膠柱進行吸附操作時

7、；另一個硅膠柱進行再生。凈化后的CO2 經(jīng)熱交換器進入貯罐，完成一次循環(huán)操作。 4、補充新鮮CO2：由于萃取釜卸料、分離釜放料以及硅膠柱再生等過程都需要放空，不可避免的會損失，故需要不斷補充。,工藝流程,工藝原理： 利用CO2超臨界流體的可調(diào)溶解性能，選擇性地提取青蒿素。通過硅膠柱色譜，進一步 提高青蒿素的收率。,方法二、大孔吸附樹脂法

8、 實驗步驟： 1.滲漉提?。狐S花蒿粗粉加60%乙醇室溫浸泡6小時，滲漉，收集滲漉液。 2.大孔吸附樹脂分離：滲漉液經(jīng)活性炭脫色，抽濾，濾液上ADS-17樹脂柱，水洗后用30%的乙醇洗脫，收集洗脫液。 3.回收溶劑-重結(jié)晶：將洗脫液于60℃減壓濃縮，回收乙醇，靜置得青蒿素粗品，再經(jīng)70%的乙醇重結(jié)晶，制得青蒿素。,工藝原理： 青蒿素在大孔吸附樹脂的表面吸附和氫鍵吸附的作

9、用下，吸附量大，易解析。,三、臨床前研究,藥理學(xué),毒理學(xué),藥代動力學(xué),藥理學(xué),1,,（1）抗瘧作用,實驗證明：青蒿素對紅細(xì)胞內(nèi)期瘧原蟲無性體有較強殺滅作用。對抗氯喹和奎寧的瘧原蟲有良好的療效。但對原發(fā)性和繼發(fā)性紅細(xì)胞外期及蚊體內(nèi)的孢子增殖無影響。本品的抗瘧作用與葉酸代謝無關(guān)，也不像氯喹等抗瘧藥那樣干擾DNA的復(fù)制，其抗瘧作用主要是破壞瘧原蟲滋養(yǎng)體的膜系結(jié)構(gòu)，干擾瘧原蟲的表膜-線粒體功能，使原蟲體無法攝取宿主紅細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)而發(fā)生腫脹、

10、死亡，并不斷排出體外。 青蒿素被瘧原蟲體內(nèi)的鐵催化, 其結(jié)構(gòu)中的過氧橋裂解, 產(chǎn)生自由基, 與瘧原蟲蛋白發(fā)生絡(luò)合, 形成共價鍵, 使瘧原蟲蛋白失去功能, 從而死亡李銳等認(rèn)為青蒿素及其衍生物通過抑制細(xì)胞色素氧化酶, 干擾原蟲膜系線粒體功能, 阻止原蟲消化酶分解宿主的血紅蛋白成為氨基酸, 使瘧原蟲無法得到供給自身蛋白質(zhì)的原料, 而迅速形成自噬泡, 導(dǎo)致蟲體瓦解死亡。Steven 等認(rèn)為青蒿素與原蟲內(nèi)的氯化高鐵血紅素反應(yīng)導(dǎo)致副產(chǎn)

11、物活性氧的產(chǎn)生, 而活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致瘧原蟲膜系統(tǒng)的損害, 從而原蟲代謝功能紊亂直至死亡。,藥理學(xué),1,,（2）抗癌作用,青蒿素可顯著降低急性白血病K562細(xì)胞端粒酶活性，抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白多聚酶。端粒酶活性增加與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，大量研究資料表明，造血系統(tǒng)的惡性腫瘤均表現(xiàn)高端粒酶活性，其活性的高低對判斷白血病的療效、惡性程度、預(yù)后及復(fù)發(fā)均有重要的臨床意義。故抑制端粒酶的活性，不僅可增加腫瘤

12、細(xì)胞凋亡，還可增加其他化療物質(zhì)的療效。,（3）抗吸血蟲作用,（4）抗心律失常,（5）增加免疫功能,毒理學(xué),2,,2.1 小鼠的急性毒性,用體重18~22克的小鼠分組.以不同劑量的青篙素混懸液一次灌胃,記錄三天內(nèi)死亡數(shù).按Burn一Karbe氏法計算半數(shù)致死量,LD50=4530士672.7mg/kg。 不同種類動物大劑量單次注射雙氫青蒿素的急性癥狀有：動物懶動、發(fā)抖，運動失調(diào)，呼吸緩慢，感覺遲鈍及反正反應(yīng)消失。鴿子、豚鼠

13、、兔、貓及狗可表現(xiàn)出痙攣性和強直性的驚厥，死前均有頻繁抽搐，先呼吸停止然后心跳停止。鴿子對雙氫青蒿素的毒性對敏感，大鼠最耐受。存活動物一般在10h~24h后逐漸恢復(fù)正常。,毒理學(xué),2,,2.2 大白鼠的長期毒性,取體重80~I00克的大鼠32只,分為四組,雌雄配搭均勻.第一組大劑量為1000mg/kg,第二組為500mg/kg,第三組為250mg/kg,第四組為對照.每天給藥一次,連續(xù)14天.給藥前稱體重.測心電、血像.給藥期間,每三天

14、稱體重一次.觀察一般表現(xiàn)及食欲.最后一次給藥后1~2小時內(nèi)測心電.停藥24小時測血像后各組處死一半.取心、肝、脾、肺、肺、腎、腦、胃作病理切片檢查.其余動物一周后再處死作病理切片檢查,結(jié)果指出:三個實驗組與對照組的體重增長率是一致的.說明青篙素對大鼠的食欲和生長沒有影響.且心電、血像和各組的病理學(xué)檢查,均無異常改變.,毒理學(xué),2,,2.2 恒河猴的長期毒性,恒河猴肌注青蒿素溶液亞急性毒性病理學(xué)研究表明：恒河猴連續(xù)14天肌注青蒿素溶液

15、，按每天肌注24mg/kg、48mg/kg、96mg/kg、192mg/kg，分別為小、中、大、特大劑量組。于停藥后3天，發(fā)現(xiàn)96mg/kg、192mg/kg組引起多種臟器組織的損傷。表現(xiàn)為骨髓紅系和粒系細(xì)胞減少、成熟發(fā)育障礙、巨核細(xì)胞增生、心肌細(xì)胞變性或灶性壞死（以超微結(jié)構(gòu)病變?yōu)橹鳎桓?、腎營養(yǎng)不良性改變；淋巴組織萎縮；注射部位損傷等。其中以骨髓和心肌損傷較為明顯。停藥后35天，上述病變明顯減輕或消失。表明青蒿素的毒副作用是可逆的。每

16、天肌注青蒿素24mg/kg、48mg/kg，為輕微中毒劑量；96mg/kg為嚴(yán)重中毒劑量；192mg/kg為致死劑量。致死原因為嚴(yán)重心肌損傷。,毒理學(xué),2,,2.3 生殖毒性,大鼠與孕后第1~6天（d1~6）灌胃青蒿素1/25LD50值 （223mg/kg），幾乎全部胎鼠發(fā)育正常；孕d6~8給藥,6.1%的胎鼠出現(xiàn)臍疝，其余發(fā)育正常；孕d9~11給藥，胎鼠全部被吸收。以小鼠進行實驗，也有類似的結(jié)果。小鼠與孕d6~15后每天肌注蒿甲醚5.

17、4mg/kg，對胎鼠的生長發(fā)育無明顯影響，肌注10.7mg/kg和21.4mg/kg則分別有30%和100%胚胎被吸收。大鼠和兔在相應(yīng)的低劑量時對胎仔生長發(fā)育亦無影響，在相應(yīng)高劑量時被胚胎大量吸收。由以上結(jié)果可知：青蒿素及其衍生物有較明顯的胚胎毒性作用，在較小劑量時即可引起胚胎吸收，對存活動物致畸性較小或無致畸性。且在不同孕期給藥時對胚胎的作用亦不同。,毒藥理學(xué),2,,2.4 致突變作用,經(jīng)Ames試驗、微核試驗未發(fā)現(xiàn)青蒿素具有誘變性。

18、經(jīng)Ames試驗、微核試驗及哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗均未發(fā)現(xiàn)青蒿素有致突變作用。,藥代動力學(xué),3,,中國青蒿素實驗小組經(jīng)大鼠實驗表明，大鼠口服青蒿素150mg/kg后，吸收迅速完全，但血藥濃度低，維持時間短，顯示有首過效應(yīng)。靜脈注射青蒿素混懸水溶液150mg/kg，血藥時程符合二室模型，t½β為30min，Vd為4.1L/kg，表明青蒿素在體內(nèi)分布廣泛，消除迅速。,3.1 大鼠的藥代動力學(xué),藥代動力學(xué),3,,健康犬10只，

19、隨機分為2組，一組采用口服方式連續(xù)給藥5日，每日1000mg，另一組采用靜脈注射方式連續(xù)給藥5日，每日60mg。各組分別于第1日、第5日采血，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定血漿中青蒿素的含量并計算主要藥動學(xué)參數(shù)?？诜M達峰濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）為實測值。以半對數(shù)作圖法，由消除相末幾個濃度點計算消除速度常數(shù) k，并根據(jù) k 計算 t½。第一日口服給藥后Cmax為29.1 ± 9.9 ng/mL，Tmax

20、為1.9 ± 0.7 h， t½為 2.6 ± 0.6 h。連續(xù) 5 日口服給藥后血藥濃度已基本測不出，未求算藥動學(xué)參數(shù)。,3.2 健康犬的藥代動力學(xué),,藥代動力學(xué),3,,靜注組以血藥濃度的對數(shù)對時間作圖得直線，由直線斜率和截距求出初始濃度C0和消除速度常數(shù) k，并計算 t½。第 1 日靜注給藥后的 t½為 0.9 ± 0.7 h。靜注連續(xù)給藥 5 日后的t½為 0.

21、2 ± 0.04 h?？诜诳诜?5 日組給藥后血藥濃度明顯低于單次給藥組，靜注組第 5 日給藥后 t½無明顯差別。結(jié)果表明多劑量口服給藥后，血藥濃度呈現(xiàn)顯著的時間依賴性降低，而靜注給藥未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，表明自身誘導(dǎo)代謝主要影響了首過代謝過程，此外該藥在犬體內(nèi)的口服生物利用度很低，口服給藥的血藥濃度遠(yuǎn)低于靜注給藥。,四、臨床實驗,（一）、臨床Ⅰ期,1、血藥濃度-時間曲線 10名受試者空腹口服青蒿素片1 00

22、0ｍｇ的平均血藥濃度-時間曲線。如下圖所示。,2、藥代動力學(xué)參數(shù)按統(tǒng)計處理方案,計算每個受試者的藥代動力學(xué)參數(shù),10名受試者空腹口服青蒿素片1 000ｍｇ的平均藥代動力學(xué)參數(shù),見下表。,本實驗選擇10名中國健康成年男性志愿者,空腹口服青蒿素片1000ｍｇ,進行藥代動力學(xué)研究。研究結(jié)果顯示,青蒿素片口服給藥后,吸收快、體內(nèi)半衰期短。,（二）、臨床Ⅱ期,,青蒿素栓劑每粒含青蒿素分別為100、200、300、400、600mg，成人總量28

23、00mg，首劑600mg，隔4h再給600mg，第2,3d上、下午各給藥400mg，小兒劑量按年齡遞減，用治惡性瘧100例，均能迅速控制臨床癥狀，平均退熱時間為（20.7±11.8）h，平均原蟲轉(zhuǎn)陰時間為（53.2±15.6）h。,青蒿素制劑有4種：片劑、油劑、油混懸劑與水浸懸劑，總量分別為2.5~3.2,0.5~0.8,0.8~1.2,1.2mg。片劑口服，每天2~4次，其余制劑均肌注給藥，療程均為3天。治抗氯喹株

24、惡性瘧143例，全部臨床治愈。治腦型瘧141例，治愈131例，治愈率為92.7%。,,（三）、臨床Ⅲ期,治間日瘧1511例，惡性瘧588例，全部臨床治愈，治愈率為100%。,人體內(nèi)的藥理學(xué),,,青蒿素類藥物抗腫瘤譜廣， 在體內(nèi)外對多種腫瘤細(xì)胞的生長均具有明顯抑制作用 ，一些新型青蒿素衍生物治療效果甚至優(yōu)于目前常用的化療藥物;對部分多藥耐藥株亦具有殺傷作用，聯(lián)合化療時能使藥效協(xié)同增強， 同時還具有放療增敏作用 ; 并且其毒副作用小 、成本

25、較低 ，預(yù)示其極可能成為具有臨床應(yīng)用價值的抗癌新藥 。 青蒿素片有增強細(xì)胞免疫功能的作用，可顯著提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，但對抗原結(jié)合細(xì)胞和抗體形成細(xì)胞有非常顯著的作用。 青蒿素片能顯著降低急性白血病K562細(xì)胞端粒酶活性，抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 青蒿素片的抗纖維化作用與抑制成纖維細(xì)胞增殖、降低膠原合成、抗組胺促膠原分解有關(guān)。,人體內(nèi)的毒理學(xué),,,經(jīng)過長期、 大規(guī)模臨床臨床應(yīng)用 ， 青蒿素被認(rèn)為

26、是低毒安全的藥物。自 1991 ～ 1995 年在泰國進行的一項研究顯示， 對 3662 名患有惡性瘧疾受試者口服給予青蒿素片，連續(xù)服用超過 7 天 后， 未 發(fā) 現(xiàn) 任 何 與 藥 物 相 關(guān) 的 毒 副 作用。目前雖然在臨床上沒有致畸的報道， WHO 建議在妊娠前 3 個月的孕婦避免使用青蒿素類藥物。肌內(nèi)注射油制劑由于釋放緩慢，藥物暴露時間長， 毒性更大 。對青蒿素類藥物抗腫瘤分子機制研究的不斷深入， 由于該類化合物存在一定的神經(jīng)

27、和胚胎毒性。,人體內(nèi)的藥代動力學(xué),,關(guān)于人體內(nèi)的藥動學(xué)資料很少，其原因是目前尚難以找到準(zhǔn)備可靠測定此類藥物血藥濃度的方法。此外，青蒿素及其代謝物可與紅細(xì)胞膜緊密結(jié)合，使其血藥濃度-時間曲線復(fù)雜化。青蒿素口服吸收快，0.5-1h達血藥峰濃度，隨后迅速下降，4h降至血藥峰濃度1/2以下，72h血中僅含微量。尿中排泄物全是代謝物，主要為氫化青蒿素和還原青蒿素，其代謝物均無抗瘧活性。青蒿素亦可經(jīng)直腸吸收，其在體內(nèi)分布廣泛，以腸、肝、腎含量較多。

28、青蒿素為脂溶性，可透過血腦屏障，并在腦內(nèi)維持較長時間。其體內(nèi)過程的特點是吸收快、分布廣、代謝和排泄快，24h可排除84%。其復(fù)燃率高可能與代謝、排泄快有關(guān)。改用油劑肌內(nèi)注射或用栓劑肛門給藥可延緩其吸收、延長作用時間，顯著降低復(fù)燃率。,1,2,3,4,呼吸系統(tǒng)疾病的介紹,,呼吸系統(tǒng)疾病的原因,祛痰鎮(zhèn)咳藥機制,五、政府審批,1986年，青蒿素獲得新一類新藥證書，獲得國家發(fā)明獎和全國十大科技成就獎。 目前，青蒿素已推向國際市場，

29、并在42個國家和地區(qū)獲得國際藥物專利注冊，使數(shù)以千萬計的瘧疾病人免于死亡。2003年世界衛(wèi)生組織又資助500萬美元向全世界推廣，成為全球一線抗瘧藥。 2006 年以來, 為克服耐藥性, 世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布改用青蒿素的聯(lián)合療法(ACT), 挽救了 80 個國家 100 多萬人的生命。2011年，青蒿素的研究者屠呦呦獲得美國紐約“拉斯克獎”。,六、上市后研究,臨床Ⅳ期,青蒿素對各種瘧疾，包括惡性瘧疾、腦型惡性瘧疾及對氯喹耐藥的瘧疾均

30、有顯著療效，治愈率100%，且臨床應(yīng)用20余年，也未有耐藥報道。其退熱時間及瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時間都較氯喹快。但對間日瘧原蟲的近期復(fù)發(fā)率較氯喹高20%~30%，與伯氨喹聯(lián)用，可使復(fù)發(fā)率降至10%左右。 此外，國內(nèi)近年來應(yīng)用青蒿素預(yù)防和治療血吸蟲病也獲得較好的療效，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡及盤狀紅斑狼瘡也均有一定的緩解作用。另據(jù)美國《生命科學(xué)》雜質(zhì)報道，離體實驗證實，青蒿素對癌細(xì)胞有選擇性殺滅作用。美國FDA已批準(zhǔn)用于癌癥的治療，包括乳腺