非金屬化合物及其代謝產(chǎn)物的測定

1、1,非金屬化合物及其代謝產(chǎn)物的測定Determination of nonmetal compounds and their metabolites,第三章,2,本章介紹內(nèi)容,,3,一氧化碳Carbon monoxide,第一節(jié),4,一、理化特性,一氧化碳（CO）是煤、木材、石油等含碳物質(zhì)燃燒不完全的產(chǎn)物，為無色、無臭、無刺激性的有毒氣體。在空氣中爆炸濃度12%～74%。水中溶解度很低，易溶于氨水?？諝庵休^穩(wěn)定。高溫下和硫反

2、應(yīng)生成羰基硫(COS)，與過渡金屬反應(yīng)生成金屬羰基化合物，對銀鹽、鈀鹽、鉬酸鹽、五氧化二碘等顯示還原性。,5,二、代謝和生物監(jiān)測指標,職業(yè)接觸非職業(yè)接觸： CO含量：火藥爆炸后氣體：30~60%； 汽車廢氣：0.6～10％； 香煙煙霧：～4%。,6,碳氧血紅蛋白,CO與血紅蛋白的親和力比O2高250倍，與血紅蛋白生成碳氧血紅蛋白（carboxyhaemoglobin）。氧合血紅蛋白的解離度比碳

3、氧血紅蛋大3000倍?！?正常人體內(nèi)碳氧血紅蛋白濃度大約為0.5％，而吸煙者碳氧血紅蛋白最高可達15％～20％。中毒死亡可達90%,詢問吸煙史,7,CO中毒,呼吸系統(tǒng)毒性，頭痛、頭暈、意識模糊、昏迷，并發(fā)腦水腫，呼吸衰竭休克致死！,8,HbCO含量 中毒癥狀評價接觸水平時注意吸煙史、用藥史、貧血等,,,生物監(jiān)測指標：血HbCO,呼出氣中CO濃度,BEI：HbCO為Hb的3.5%；CO 23.4ppm（均為班末）；B

4、EL： HbCO為Hb的5%（班末）。,9,CO的體內(nèi)代謝,吸收后的CO絕大部分以原形由肺部排出，排出速度取決于從血紅蛋白釋放的快慢、肺通氣量、吸入氧氣的濃度和HbCO的濃度等。CO半排出期128～409min，平均約300min。,10,三、樣品采集及保存,呼出氣 接觸CO后3h臨近班末進行，收集終末呼出氣。按常規(guī)采集，收集在采樣管或復(fù)合膜采氣袋中，密封，帶回實驗室盡快測定。,11,血液 HbCO的生物半

5、減期約為5h，應(yīng)在接觸CO3h后的班末或接觸最高濃度時采集靜脈血或末稍血。血樣置于加肝素的密閉容器中，4℃保存可一周。用氟化鈉作防腐劑。受檢者在采樣當天不能吸煙。,12,一氧化碳的生物監(jiān)測,呼出氣中一氧化碳濃度：采用氣相色譜法。但要求衍生，操作復(fù)雜。血液碳氧血紅蛋白：采用分光光度法,13,四、血中碳氧血紅蛋白的測定WS/T 42-1996,（一）分光光度法 1. 原理：血液中含還原血紅蛋白（Hb），氧合血紅蛋白（HbO

6、2），碳氧血紅蛋白（HbCO）及微量高鐵血紅蛋白（MetHb）。用還原劑連二亞硫酸鈉將HbO2和HbMet還原為Hb，血樣中只有HbCO和Hb。HbCO 和Hb的最大吸收波長分別為420nm和430nm，測定血樣在兩波長下的A，用公式計算求得HbCO百分濃度 本法最低檢測濃度為2%HbCO（0.02吸光度對應(yīng)濃度，10µl血樣），測定范圍2%～70％HbCO。,14,2．樣品測定,冷藏血樣室溫放置，混勻。迅速取1

7、0ml，加入內(nèi)盛15ml Tris溶液的具塞試管中(或直接取血10ml)，加入60mg連二亞硫酸鈉，輕輕混勻放置10min，測其在420nm和430nm處的吸光度值。,15,結(jié)果計算,式中：X ——血中碳氧血紅蛋白的濃度，%；A420——血樣420 nm的吸光度值；A430——血樣430nm的吸光度值；K1——HbCO420 nm吸光常數(shù)；K2——HbCO430nm的吸光常數(shù)；K3——Hb420 nm吸光常數(shù)；K4——Hb

8、430 nm吸光常數(shù)。,,16,吸光度的加合性原則A420=K1.CHbCO+K3.CHbA432=K2.CHbCO+K4.CHbK2A420=K1K2CHbCO+K2K3CHb (1)K1A432=K1K2CHbCO+K1K4CHb (2)(1)-(2):K2A420-K1A432=K2K3CHb-K1K4CHbCHb=K2A420-K1A432/K2K3-K1K4

9、CHbCO=K4A420-K3A432/K1K4-K2K3CHbCO%=CHbCO/CHbCO+CHb,怎么來的呢？,,,17,3.摩爾吸光系數(shù)的測定,取不吸煙健康人血液（肝素抗凝），水稀釋5倍，取0.3ml用稀釋液（Tris）稀釋至90ml。 通氧氣30min（流速30ml/min）。 從中取4份，每份15ml于試管中；其中2份通氮10min除氧，得HbO2液。另2份通純CO10min，得HbCO液。立即將HbO2、HbC

10、O制備液分別轉(zhuǎn)入盛Na2S2O4試管中，放10min后測430nm和420nm的吸光度值作為計算用摩爾吸光系數(shù)。,,,,,,,,,,,,,一氧化碳,,,氧氣,,,氮氣,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,水稀釋5倍,抗凝健康人血,用Tris稀釋至90ml,通氧30min(30ml/min),,,,,通氮10min,通CO10min,各取15ml,立即將HbO2、HbCO制備液分別轉(zhuǎn)入盛Na2S2O4試管中，放10min后測430n

11、m和420nm的吸光度值作為計算用摩爾吸光系數(shù)。,摩爾吸收系數(shù)測定示意圖,取0.30ml,19,Tris緩沖液,Tris即三羥甲基氨基甲烷〔tris (hydroxymethyl) aminomethane〕。分子式： C4H11NO3，分子量： 121.14， 為白色結(jié)晶體，溶于甲醇、乙酸等有機溶劑。,20,Tris-HCl的優(yōu)點： 對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。電泳電流小。   

12、    缺點：①pH值受溶液濃度影響較大，稀釋十倍，pH值的化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對pH值的影響大，即： △pKa／℃＝－0.031 ，4℃時緩沖液的pH＝8.4，則37℃時的pH＝7.4，一定要在使用溫度下配制 ③易吸收空氣中的CO2，配制的緩沖液要蓋嚴密封。 ④此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。,21,磷酸鹽緩沖液優(yōu)點：容易配成各種濃度和p

13、H的緩沖液，受溫度影響小，抗稀釋。 缺點：與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀；會抑制某些生化過程，如酶的活性。電泳電流大。 有機酸緩沖液（甲酸、乙酸、檸檬酸等）：天然的代謝產(chǎn)物。對生化過程產(chǎn)生干擾；易與Ca2+結(jié)合。 硼酸緩沖液：堿性范圍常用緩沖液；易與代謝物絡(luò)合，尤其與糖類羥基生成復(fù)合物影響。,22,應(yīng)用高純氮和氧，否則微量一氧化碳干擾測定。 連二亞硫酸鈉遇水易分解，在空氣中易被氧化，應(yīng)以小瓶分裝使用，避

14、免接觸空氣和水分?？捎肐2標定。 測定吸光系數(shù)必須采用新鮮血液，一次測定值在儀器波長穩(wěn)定的情況下可以使用一段時間。 測試液應(yīng)盡量避免接觸空氣，及時測定，否則會造成結(jié)果偏低。,,注意啦！,23,（二）氫氧化鈉法,1．原理 正常人血樣在堿性條件下立即轉(zhuǎn)變成草綠色（堿性正鐵血紅素的形成），而存在碳氧血紅蛋白會使顏色轉(zhuǎn)變時間增長，顏色轉(zhuǎn)變所需時間與碳氧血紅蛋白濃度之間存在相關(guān)性，從變色時間大致估計出碳氧血紅蛋白的濃度。,24,,,,,

15、,,2滴氫氧化鈉,,,,,,,,轉(zhuǎn)變時間測定,,陰性,,查表得HbCO,2．測定方法,25,變色時間與碳氧血紅蛋白濃度,26,其他的鑒定實驗,1．煮沸法 取血2~3ml水浴加熱，發(fā)生凝固。一氧化碳血呈磚紅色凝固體，正常血呈褐色或黑褐色凝塊。 簡便快速，含量40％才可測出。 2．硫化銨法 取水10ml，血5滴，硫化銨5滴混合，加少量10％醋酸使微呈酸性，一氧化碳血呈玫瑰色，正常血為綠褐色。 此法靈敏

16、，含量在10％即可檢出。 取正常血同時做對照試驗，以作對比。,現(xiàn)場，快速！,27,五、終末呼出氣中一氧化碳濃度測定,（一）CO測定儀法 可用便攜式CO測定儀 (CO傳感器） CO紅外測定儀，利用CO對4.67µm、4.72µm波長的紅外輻射具有選擇性吸收的原理定量。 CO電化學(xué)測定儀，CO分子在擴散式電極上氧化，電化學(xué)方法檢測定量。（可與報警器配套使用 ） 催化型可燃氣體傳

17、感器 擴散型CO測定儀的原理是CO經(jīng)擴散后遇到專用指示膠產(chǎn)生由粉紅色至棕色的顏色變化而定量。,28,CO電極反應(yīng),工作極上CO + H2O → CO2 + 2H+2e對極上 O2 + 4H+4e→2H2O總反應(yīng) 2CO + O2 → 2CO2 在工作電極上所釋放的電子產(chǎn)生的電流與 CO 濃度成正比,29,氣相色譜法,原理 在鐵氰化鉀存在下，加熱使血樣中CO釋放出來，在色譜柱上與其他氣體分離，然后用熱導(dǎo)池檢測器測定，

18、或轉(zhuǎn)化為甲烷（H2）后，用火焰離子化檢測器測定。用血量各為2ml和1ml。,30,第二節(jié),二硫化碳Carbon disulfide,31,一、重要理化特性,二硫化碳能自燃。常溫為無色透明。難溶于水，能溶于強堿和有機溶劑。易揮發(fā)、易燃、易爆、具腐蝕性，蒸氣比空氣重2.63倍。二硫化碳體內(nèi)代謝產(chǎn)物2-硫代噻唑烷-4-羧酸（2-thio-thiazolidine-4-carboxylic acid，TTCA）， 是二硫化碳與谷胱甘肽結(jié)合所

19、生成的特異性代謝產(chǎn)物。,,32,二、毒性、代謝,CS2,,80%,,原形呼出,血液,,肝腎,,尿,代謝物,33,二硫化碳在體內(nèi)代謝途徑,,34,三、CS2的生物監(jiān)測指標,班末尿中TTCA可作為接觸CS2的生物指標。周末、班末尿中TTCA的濃度高于工作周第一班末的尿樣。呼出氣中二硫化碳濃度也可作為生物監(jiān)測指標BEI: TTCA 5mg/g肌酐（班末）；BEL: TTCA 2.2mg/g肌酐（班末）。,35,樣品采集,1. 尿樣

20、 尿樣采集時間為工作班末或周末。采集后盡快測定，置于－8℃冰箱中可保存1周。2. 呼出氣 常規(guī)采樣。,36,四、CS2及其代謝產(chǎn)物的測定方法,呼氣中CS2用氣相色譜法測定（WS/T41-1996）。碘－疊氮化鈉褪色法：尿中CS2的代謝產(chǎn)物催化碘還原成碘離子，根據(jù)碘褪色所需時間及尿樣中肌酐含量計算。靈敏度低、特異性差。HPLC法：定量測定尿中TTCA。 TTCA很少商品出售，需自己合成。非職業(yè)接觸者尿中不含TTCA。,3

21、7,五、TTCA的高效液相色譜法,1. 原理 尿樣經(jīng)鹽酸酸化后，用乙醚萃取TTCA，濃縮后進樣HPLC，經(jīng)反相C18柱分離，紫外檢測器273nm測定。以保留時間定性，峰高定量。,38,3. 樣品處理及測定,1ml經(jīng)離心后的尿樣,,漩渦混勻2min,,3000rpm離心10min,,乙醚 5ml,,0.1ml 2mol/L HCl,乙醚層40℃水浴氮氣揮干,,0.20ml甲醇溶解后HPLC分析,,39,4. 儀器操作條

22、件,色譜柱：反相C18柱；柱溫：室溫；流動相：甲醇－水－冰乙酸＝14.5＋84.5＋1流速：1.5ml/min；紫外檢測波長：273nm。,40,尿樣TTCA液相色譜圖,本法最低檢測濃度20µg/L（尿樣1ml）,41,5. 注意事項,TTCA的制備方法 1.12g碳酸鉀/6ml水 ＋ 0.96g L－胱氨酸，溫熱至全溶，冷至室溫后，加CS2 1.2ml，強烈攪拌24h。反應(yīng)完全后，調(diào)pH1.0，以1

23、00ml乙醚分3次提取，然后用3ml10％HCl洗滌。用無水硫酸鎂干燥乙醚層，再真空干燥，得粗品TTCA。用1:1HCl加熱溶解，再用少許活性炭脫色，趁熱過濾，濾液冷卻后，析出無色針狀結(jié)晶TTCA（mp180℃），烘干即可。,42,六、呼氣中CS2的GC法測定,1. 原理 將終末呼出氣收集在雙閥氣管中，直接進樣，或?qū)悠犯患诟叻肿佣嗫孜⑶蛭絼┥?，熱解吸后進樣，經(jīng)OV-17色譜柱分離，F(xiàn)ID檢測器檢測，以保留時間定性，峰高或

24、峰面積定量。OV－17:苯基(50%)甲基硅酮phenyl methyl silicone(50%),43,2. 樣品采集、保存和處理,受試者正常呼吸1min后，將雙閥采氣管兩端活塞打開，采樣管一端含入口中，向管內(nèi)深吐氣，吐氣完畢關(guān)上兩端活塞。室溫存放，24h內(nèi)分析。當濃度太低時，需將樣品富集，方法是：將采氣管一端接TenaxGC管，另一端接100ml注射器，用6倍于采氣管體積的空氣或氮氣以200ml/min速度沖洗，將管內(nèi)樣品富集

25、在Tenax GC管中測定。,44,3. 儀器操作條件,色譜柱：1m×3mm不銹鋼柱，填充OV-17（丙酮溶劑），Chromosorb W AW DMCS（80~100目）= 5+100。柱溫：70℃；氣化室溫度：120℃；檢測室溫度200℃；載氣：N236ml/min；助燃氣：air 220ml/min；燃氣：H2 175ml/min。檢測器：FID；140℃解吸3min。Chromosorb W AW DMCS即經(jīng)酸

26、洗（AW）并經(jīng)二甲基二氯硅烷（DMCS）處理過的多孔性高分子微球W（chromosorb W）。,45,4. 樣品測定,直接進樣：用注射器從采氣管中抽取呼氣樣1.00ml直接進樣；重復(fù)3次，以標準曲線法定量。濃縮進樣：將已富集樣品的Tenax GC管的進氣端作為出氣端，聯(lián)接在色譜柱進樣口?？刂茻峤馕鼤r間為3min進行測定。標準曲線法定量,46,CS2 GC圖譜,47,5. 注意事項,采集不同階段的呼氣結(jié)果不同，為保證結(jié)果準確，采集肺