與ZNF446同源的LT-7在布魯菌侵染THP-1中對MAPK通路影響的研究.pdf

1、目的：布?。˙rucellosis）是一種嚴(yán)重危害人和動物健康的人獸共患傳染病。巨噬細(xì)胞是布魯菌生存和繁殖的靶細(xì)胞之一，布魯菌的胞內(nèi)生存與抑制宿主細(xì)胞凋亡有關(guān)，外膜蛋白 OMP25(Outer Membrane Protein25)在布魯菌的毒力及胞內(nèi)寄生中起重要作用。前期，本課題組應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選出與布魯菌OMP25特異性結(jié)合的42個環(huán)形七肽，通過生物信息學(xué)分析，LT-7C與鋅指蛋白ZNF446（Zinc Finger Prot

2、ein Peptide446）對應(yīng)區(qū)域有100％的同源性。本研究以布魯菌RB51(Brucella abortus strain RB51)侵染THP-1(human leukemia cell line)細(xì)胞，研究LT-7C在不同階段對MAPK通路(MAPK signal pathway)的影響，進(jìn)而探討LT-7C對細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　本研究利用合成的環(huán)形七肽與THP-1共孵育，采用MTT法進(jìn)行多肽的毒性檢測

3、，選擇合適的七肽濃度與THP-1共孵育，實驗設(shè)未感染組和感染組，包括未感染對照組、未感染線性七肽組、未感染環(huán)形七肽組、感染對照組、感染線性七肽組和感染環(huán)形七肽組。以MOI(multiplicity of infection)為50:1建立RB51感染THP-1細(xì)胞的感染模型。分別收集4、8、12、24h和48h的感染細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測不同時間段的早期凋亡率；感染4h和48h時，曲拉通裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)布魯菌計數(shù)；采用qRT-PC

4、R技術(shù)和Western blot檢測4h和48h MAPK通路中ERK1/2、JNK1/2、P38的mRNA水平和蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)合成的環(huán)形七肽對THP-1無毒副作用；
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：在未感染組中環(huán)形七肽組和線性七肽組與對照組比較早期凋亡率隨著時間的變化呈上升趨勢，統(tǒng)計學(xué)分析各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在感染組中環(huán)形七肽組和線性七肽組與感染對照組比較12h前呈上升趨勢，

5、12h后呈下降趨勢，其中4h時感染環(huán)形組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；48h時感染環(huán)形組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　(3)CFU計數(shù)結(jié)果顯示感染環(huán)形七肽組早期4h時胞內(nèi)細(xì)菌量低于感染對照組，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；線性七肽組4h胞內(nèi)含菌量高于感染對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；48h時各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示4h時感染線性組LT-7組和感染

6、環(huán)形LT-7C組erk1的拷貝數(shù)低于感染對照組，ekr2、p38、jnk1和jnk2拷貝數(shù)在各感染組無變化，未感染組4h時各基因的拷貝數(shù)無變化；48h時感染環(huán)形組中jnk1/2拷貝數(shù)低于感染對照組；erk1、ekr2、p38拷貝數(shù)在各感染組無變化，未感染組48h時各基因的拷貝數(shù)無變化；
　?。?）Western blot結(jié)果與qRT-PCR一致。
　　結(jié)論：
　　(1)以MOI為50:1的RB51感染的環(huán)形七肽組中，環(huán)