ih復(fù)習(xí)提綱

1、IH復(fù)習(xí)提綱,一、課程性質(zhì)及特點(diǎn) 免疫組織化學(xué)是一門(mén)研究利用核素或非核素標(biāo)記物作為顯示手段，并借助免疫化學(xué)或親合化學(xué)的專一性和高靈敏性，原位示蹤組織或細(xì)胞中的抗原或抗體的應(yīng)用科學(xué)，是一項(xiàng)敏感、特異的原位示蹤染色技術(shù)。 特點(diǎn)：特異、敏感（ng或pg水平），原位、形態(tài)-機(jī)能-代謝三位一體。,二 、技術(shù)類型 IH的技術(shù)類型多樣，彼此通用，各有特點(diǎn)。（1）以標(biāo)記物種類分：放射免疫自顯影，免疫熒光、免

2、疫酶標(biāo)、親合免疫酶標(biāo)、絡(luò)合放大免疫酶標(biāo)（CSA 、 Epos 、 EnVision 、 UIP） 、 免疫重金屬標(biāo)記（膠體金、鐵蛋白）等 。,（2）以標(biāo)記物交聯(lián)特點(diǎn)分：標(biāo)記抗體（直接法和間接法）、不標(biāo)記抗體（橋法和復(fù)合物法）。（3）以顯示敏感度分；單標(biāo)記、重復(fù)標(biāo)記（雙PAP、PAP-ABC法等）、網(wǎng)絡(luò)標(biāo)記（EnVision、CSA法等）。,目前應(yīng)用較廣且較為敏感的技術(shù)有PAP、S-P、sABC、IGSS（間接法）和EnVision法等

3、。一般來(lái)說(shuō)，免疫光鏡多采用S-P（間接法）、sABC法-HPO、IGSS法（間接法）和EnVision（間接法）；免疫電鏡多采用IGS法（間接－－包埋后）。,三、免疫試劑 IH的關(guān)鍵試劑為抗體：計(jì)有特異性抗體（第一抗體-示蹤試劑）、橋連抗體（第二抗體-放大試劑）和標(biāo)記抗體（第三抗體、-顯示試劑）等。目前商品化的各種抗體試劑多為鼠系單克隆抗體，應(yīng)用中必需注意種系匹配和免疫學(xué)親和對(duì)應(yīng)原理。,四、組織處理和切片選擇免疫組織

4、化學(xué)中組織處理的原則是“ 保留抗原、維護(hù)結(jié)構(gòu)”；操作中注意“ 及時(shí)固定、溫和短時(shí)”；“ 石蠟優(yōu)先，冰凍跟上”；“ 暴露決定簇，阻斷內(nèi)源干擾”。,常用于石蠟包埋組織固定劑有：10％中性甲醛、4％緩沖多聚甲醛、PLP液等。 載玻片做到清潔、無(wú)塵、防脫片（預(yù)涂粘片白膠-10%或多聚賴氨酸0.05%或3-氨丙基三乙氧硅烷2％）。,▲五 、 方法原理與選擇根據(jù)免疫組化染色方法類型眾多，基本原理大同小異，但由于標(biāo)記

5、交聯(lián)顯示方法的不同，其技術(shù)的檢測(cè)敏感性上存在某些差異，可按工作實(shí)際與實(shí)驗(yàn)室條件，加以選用。,目前文獻(xiàn)中仍以酶標(biāo)記應(yīng)用報(bào)道最多，尤其是與親合物的結(jié)合。例如LsAB－HPO間接法(或稱SP 間接法 ），sABC-HPO法，LsAB-AKP法， sABC -AKP法，其次是PAP法或APAAP法，IGSS間接法。 免疫熒光間接法尚有一定應(yīng)用價(jià)值，仍可見(jiàn)于諸文獻(xiàn)報(bào)道。免疫膠體金間接法（5nm或10nm）主要應(yīng)用于免疫電鏡。,新近

6、，為了適應(yīng)快速I(mǎi)H診斷的需要，采用高分子葡聚糖作交聯(lián)載件，預(yù)先連接標(biāo)記酶和抗體，組成巨大免疫示蹤試劑分子，使免疫組化染色操作流程大大簡(jiǎn)化和標(biāo)準(zhǔn)化，并由于檢測(cè)復(fù)合物的分子量的增大而進(jìn)一步提高了方法的靈敏度。該類增敏放大方法有多種，其中以EnVision法的應(yīng)用報(bào)道 最多，并已有商品試劑供應(yīng)。,酶標(biāo)親合素（sA）生物素（B）化二抗一抗Ag,,,sA,HPO,AKP,LsA-AKPb-Ab2Ab1Ag,,LsAB-H

7、PO（間接法）,LsAB-AKP（間接法）,ABC-HPOb-Ab2Ab1Ag,B,,,ABC-AKPb-Ab2Ab1Ag,,sABC-HPO sABC-AKP法,PAPAb2Ab1Ag,APAAPAb2Ab1Ag,,,PAP法 APAAP法,銀顯影G －Ab2Ab1

8、Ag,,S,G,,,,,,,,,Ab2-熒光素（FITC）Ab1Ag,IGSS（間接法）,IF（間接法）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,EnVision(葡聚糖)酶(HRP或AP)標(biāo)抗體間接法,標(biāo)記第二抗體葡聚糖酶絡(luò)合物,特異性抗體(一抗),CSA酶催化生物素化酪胺級(jí)連放大法,,b,,,級(jí)聯(lián)放大的酶標(biāo)記，SAB酪胺抗原抗體免疫復(fù)合物,,生物素化酪胺基團(tuán),鏈霉親合素標(biāo)記酶(HRP或AP),生物素化二抗,特異

9、性抗體(一抗),方法選擇可根據(jù)檢測(cè)抗原的量與脆性而定，抗原含量高，抗性強(qiáng)則允許選擇放大效率低的染色法（如間接法），若抗原含量少，脆性大的膜抗原或微量抗原則多選擇復(fù)合物法或親合標(biāo)記法，甚至在底物顯色反應(yīng)前重復(fù)免疫操作流程，以進(jìn)一步提高染色方法的靈敏度，降低檢測(cè)閾值，如雙PAP法、雙APAAP法、PAP－ABC法等。,目前多選用微波修復(fù)的聚合物或絡(luò)合物免疫標(biāo)記（如EnVision-HPO法、CSA法等）。 酶標(biāo)記方法的靈敏

10、度由高到低依次為：EnVision-HPO、S-P、ABC、PAP、酶標(biāo)抗體間接法。,免疫電鏡則多選擇電子密度高的IGS間接法。采用包埋前法需注意改善細(xì)胞膜的穿透性，包埋后法則強(qiáng)調(diào)抗原的保護(hù)，前后固定劑選擇要求溫和、短時(shí)、有效，必要時(shí)可不用鋨酸后固定或鉛鈾復(fù)染。 顯色劑與標(biāo)記酶要專一，應(yīng)用中還需注意試劑的溶解特性，正確選擇封片方式。,★六 、對(duì)照染色與結(jié)果判定 對(duì)照染色設(shè)置是IH中十分重要 和 關(guān)鍵的一項(xiàng)操作，

11、它涉及IH染色結(jié)果的正確判定和假陽(yáng)性，假陰性異常錯(cuò)誤結(jié)果的識(shí)別。,常用的免疫組化的對(duì)照，有陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照，陰性試劑對(duì)照（主要是特異性抗體）和自身組織對(duì)照。其中以陰性試劑對(duì)照最為重要，包括有：,（1）空白對(duì)照（省去一抗或用PBS或TBS替代）；（2）替代對(duì)照（用動(dòng)物正常血清或無(wú)關(guān)抗體替代特異性一抗）；（3）吸收試驗(yàn)對(duì)照（用事先經(jīng)過(guò)量抗原吸收過(guò)的一抗上清液染色）；（4）競(jìng)爭(zhēng)或抑制試驗(yàn)對(duì)照（用一定比例混合的標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗

12、體的試劑染色）,預(yù)實(shí)驗(yàn)，特別是稀少抗原的檢測(cè)，首創(chuàng)性的研究工作，陰性試劑對(duì)照的類型盡可能多選做幾種，以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果和所用試劑的特異性和可靠性。正式實(shí)驗(yàn)為節(jié)省工作量，可只做空白對(duì)照，而且需與實(shí)驗(yàn)切片同步操作，其結(jié)果必需是陰性。,*附：原位PCR 一般常用間接法——即先行PCR核酸擴(kuò)增，后再做ISH的原位顯示核苷酸方法 ，其技術(shù)原理和操作要求基本上同一般原位分子雜交，但靈敏度更高，對(duì)照要求更嚴(yán)。,其對(duì)照設(shè)置除要求用不含探針的預(yù)雜

13、交液替代特異性雜交液的空白對(duì)照外，還要做核酸酶（DNA酶或RNA酶）消化后的陰性對(duì)照，必要時(shí)還要做質(zhì)?；蛘xRNA探針的替代對(duì)照，以排除假陽(yáng)性或假陰性的干擾。,★七 、 IH的質(zhì)量要求 （1）特異染色鮮明、清晰，背景本底較弱，二者反差明顯，比值>1。 （2）陽(yáng)性顯色定位正確。 （3）對(duì)照染色結(jié)果附合要求，陰性試劑對(duì)照必需是陰性結(jié)果。,▲八 、增強(qiáng)特異性染色抗原或信號(hào)丟失，其次是方法靈敏度不足 特異性染色

14、結(jié)果不佳或缺如（陰性）的主要原因是組織處理不當(dāng) ，或試劑，操作不當(dāng)，底物陳舊等。,增強(qiáng)特異性染色的措施一般有： （1）延長(zhǎng)染色孵育時(shí)間，特別是一抗。 （2）多重孵育反應(yīng)（即重復(fù)主要操作流程）。 （3）降低背景（洗滌或稀釋緩沖液中加入0.2～1％ Triton×-100或1％BSA；10％正常血清或1％BSA預(yù)孵育等）。,（4）提高組織細(xì)胞的通透性（如凍融、提高稀釋緩沖液的離子濃度和滲透壓等）。

15、 （5）微波修復(fù)或蛋白酶預(yù)消化。假陰性是指陽(yáng)性組織對(duì)照呈現(xiàn)陰性的實(shí)驗(yàn)切片陰性結(jié)果。,▲ 九 、非特異性染色背景 凡非屬靶抗原與其特異性抗體結(jié)合反應(yīng)引起的標(biāo)記顯色或熒光，均稱為非特異性染色，又稱背景染色。原位PCR或原位分子雜交染色中的非特異信號(hào)或稱本底，則指非屬特異性探針與靶序列堿基配對(duì)所產(chǎn)生的雜交信號(hào)。,非特異染色或信號(hào)是IH或IS- PCR 產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因，產(chǎn)生的因素很多，包括來(lái)自組織細(xì)胞本身，標(biāo)記物或探

16、針及試劑的質(zhì)量，操作失誤等。降低非特異染色背景或本底的措施有：,（1）清除血清中未結(jié)合的游離熒光素，聚合物或雜抗體;（2）組織切片用正常動(dòng)物血清（或BSA）預(yù)孵育阻斷非特異性反應(yīng)位點(diǎn)或特異性抗體試劑中混雜的白蛋白抗原（不洗）; （3）阻斷內(nèi)源酶活性或其它內(nèi)源物干擾;（4）提高第一抗體的稀釋度和相對(duì)延長(zhǎng)孵育反應(yīng)時(shí)間;,（5）選用IgG的片段（Fab’等）作免疫試劑（避免體內(nèi)Fc受體的干擾）;（6）提高洗脫緩沖溶液的離子強(qiáng)度（如內(nèi)含

17、0.5M Nacl，pH8.6緩沖液洗滌）;（7）用0.1mg/ml NaBH4預(yù)處理切片10min（去除甲醛色素干擾）;（8）底物顯色劑（如DAB/H2O2）臨用前新鮮配置：過(guò)濾（避免氧化物沉積干擾）。 假陽(yáng)性是指陰性試劑對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)切片陽(yáng)性。,十 、標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用目前，IH染色技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究和外檢病理診斷，但實(shí)施中隨意性太大，操作欠規(guī)范，方法標(biāo)準(zhǔn)各異，判斷認(rèn)識(shí)尺度不一，有待統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用中需在下列問(wèn)題