微生物基本操作講義

1、微生物檢測的基本操作知識,主要內容：,§ 1　清洗、消毒和滅菌§ 2　顯微操作§ 3　制片和染色§ 4　培養(yǎng)基的制備§ 5　接種、分離純化和菌種保存§ 6　微生物常規(guī)鑒定技術,§ 1 　清洗、消毒和滅菌,1. 玻璃器皿的清洗 1.1新購的玻璃器皿 　　浸泡于１～２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時，除去游離的堿性物質1.2用過的玻璃器皿 　　污染的器皿，必須經過適

2、當消毒， 　　污跡不能洗凈時，可浸泡于洗液內。 1.3洗液的配制 　　　稱取重鉻酸鉀100g與1000mL水置大燒瓶中加熱攪拌溶化，待冷卻后，將燒瓶置冷水中，慢慢加入濃流酸250mL，并不斷攪拌。,消毒滅菌的方法,（一）物理消毒滅菌法（二）化學消毒法,（一）物理消毒滅菌法,1.熱力滅菌法 　　　熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。在同一溫度下， 后者效力比前者為大，這是因為： （1）濕熱中細菌菌體蛋白較易凝固；（2）濕

3、熱的穿透力比干熱大；（3）濕熱的蒸汽有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時釋放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。,加熱滅菌和加熱消毒的方法：,干熱滅菌法 火焰滅菌法 干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌 巴氏消毒法

4、 常壓下 煮沸消毒法 濕熱滅菌法 間歇滅菌法 常規(guī)加壓滅菌法 加壓下

5、 (高壓蒸汽滅菌法) 連續(xù)加壓滅菌法,,,,,,干熱滅菌法,1.焚燒：是一種徹底的滅菌方法，但僅適用于廢棄物品或尸體等。2.燒灼：直接用火焰滅菌，適用于微生物學實驗室的接種環(huán)、試管口等的滅菌（圖3-2）。3.干烤：用烤箱滅菌。一般加熱至160℃～170℃經2小時。適用于高溫下不變質、不蒸發(fā)的物品， 如玻璃器

6、皿、瓷器等。。,濕熱滅菌法,1.煮沸法：1個大氣壓下，煮沸的水溫為100℃，一般細菌繁殖體煮沸5分鐘即被殺死。細菌芽胞常 需煮沸1～２小時，才被殺死。水中加入 2%碳酸鈉，既可提高沸點達105℃，促進細菌芽胞的殺滅，又 可防止金屬器皿生銹。 2.巴氏消毒法（pasteurization）:用較低溫度殺滅液體中的病原菌、同時又不影響消毒物品的營 養(yǎng)成分及香味的消毒方法。加熱61.1～62.8℃半小時即可，常用于牛奶和酒類等的消毒。,3.

7、 間歇滅菌法（fractional sterilization）:將待滅菌的物品100℃ 加熱15～30分 鐘，殺死其中的細菌繁殖體，然后將物品置于37℃溫箱中過夜使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過流通蒸 汽加熱，如此連續(xù)三次，可將所有細菌繁殖體和芽胞全部殺死。 4.高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應用最廣的滅菌方法。方法是在一密閉蒸鍋—高壓蒸汽 滅菌器內進行的。通常 在1.05kg/cm2的壓力下，溫度達121.3℃,維持15～30

8、分鐘，可殺死包括細菌芽胞在內的所有微生物。 此法適用于耐高溫和不怕潮濕物品的滅菌。,2.紫外線與射線滅菌法,1.紫外線：紫外線波長為240～280nm時具有殺菌作用，其中 以260nm最強。紫外線殺菌機理主要是作用于細菌DNA，使同一條DNA 鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶共價結合而形成嘧啶二聚體，因而改變DNA的分子構型，干擾細菌DNA的復制與 轉錄，導致細菌的死亡或變異。紫外線穿透力差，故只適用于空氣及不耐熱物品的表面消毒。 2.電離輻射

9、：高速電子、X 射線和γ射線等在足夠劑量時，對各種細菌均有致死作用。其機制在于 產生游離基，破壞細菌DNA。電離輻射常用于大量一次性醫(yī)用塑料制品的消毒。,3.濾過除菌,濾過除菌是用物理阻留的方法將液體或空氣中的細菌除去，以達到無菌的目的。所用的器具是濾菌器（filter）。　　　濾過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、細菌毒素、抗生素，以及空氣等的除菌?！　　V菌器的種類很多，目前常用的有濾膜濾菌器、石棉濾菌器（亦稱Seitz濾菌

10、器）、玻璃濾菌器等。,（二）化學消毒法,用化學藥品進行消毒的方法，由于化學藥品對細菌及人體都有毒性，故只能用于體表、醫(yī)療器械及周圍環(huán)境等的消毒。 殺菌機制：（1）使菌體蛋白質變性或凝固；（2）干擾細菌的酶系統(tǒng)和代謝；（3）影響細菌胞漿膜的通透性。,影響消毒滅菌效果的因素,1.消毒劑的性質、濃度和作用時間：一般情況下濃度越大，作用時間越長，殺菌效果越好。但95%的 乙醇消毒效果反不如75%為好，因為高濃度乙醇使細菌表面的蛋白質迅速

11、脫水而凝固，影響乙醇進入菌體內，減弱其殺菌作用。 2.微生物的種類與數(shù)量：同種消毒劑對不同微生物的殺菌效果不同。如結核桿菌對酸、堿的抵抗力 比其他的菌強；70%乙醇可殺死一般細菌繁殖體，但不能殺滅細菌芽胞。因此，必須根據(jù)消毒對象選擇合適的消毒劑。3.環(huán)境中有機物的影響：消毒環(huán)境中如有有機物存在，如血清、膿汁、痰、糞便等，可與消毒劑結合而影響殺菌效果。,§ 2　顯微操作,顯微鏡是微生物檢驗中最常用的精密光學儀器。顯微鏡的種

12、類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗中最常用的是普通光學顯微鏡。,,普通顯微鏡的使用方法,1低倍鏡觀察 2高倍鏡觀察 3油浸鏡觀察 　　使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動，油浸鏡所用的油要潔凈。,普通顯微鏡的保養(yǎng),(1)觀察完后，移去觀察的載玻片標本。(2)用過油浸鏡的，應先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙

13、將二甲苯擦去。(3)轉動物鏡轉換器，放在低倍鏡的位置。(4)將鏡身下降到最低位置，調節(jié)好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙 ，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。,染色方法,(一)簡單染色法 簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態(tài)。,(二)復染色法 　用兩種或多種染料染細菌，目的是為了

14、鑒別不同性質的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。 　革蘭氏染色法：不僅能觀察到細菌的形態(tài)，而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：　染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；　染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示?！〖毦鷮Ω锾m氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。,實驗材料,1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。

15、2.石炭酸復紅染液、草酸銨結晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液3.菌種,實驗內容與步驟,(一)細菌的簡單染色步驟 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片 取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了

16、使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。,3．固定 手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復紅、草酸銨結晶紫或美藍任選一種)一滴，使

17、染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗 斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。,7．鏡檢(二)細菌的革蘭氏染色步驟 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察1．取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。

18、2．用草酸銨結晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色 為止，大約需時20~30s，隨即水洗。,5．用蕃紅染液復染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。,革蘭氏染色圖解,,革蘭氏染色試劑,,步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上,,步驟2：用無菌操作法取少許培

19、養(yǎng)物于蒸餾水滴上,,步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層,,步驟4：風干,,步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定,,步驟6：結晶紫染色1分鐘,,步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片,,步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗,,步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗,,步驟10：番紅復染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗,,大腸桿菌（Escherichia coli）革蘭氏染色圖,革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）,,金黃色葡萄球菌

20、（Staphylococcus aureus）革蘭氏染色,革蘭氏染色陽性球菌（紫色）,注意事項,1．革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須 嚴格把握脫色時間。2 ．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。,4.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項,4.1培養(yǎng)基配方的選定

21、　　同一種培養(yǎng)基的配方在不同資料中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規(guī)定進行配制外，一般均應盡量收集有關資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。,4.2培養(yǎng)基的制備記錄,每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，復制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。,4.3培養(yǎng)基成分的稱取

22、,培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?，每稱完一種成分即在配方上做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱取完畢后，即移放于右側。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。,4.4培養(yǎng)基各成份的混合和溶化,使用不銹鋼鍋或大燒杯等加熱溶化，不能用銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時攪動、以防焦化，如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使

23、用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。,4.5培養(yǎng)基pH的初步調正,因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養(yǎng)

24、基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質量。PH調整后，還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。,4.6培養(yǎng)基的過濾澄清,液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀，必要時，采用過濾或其它澄清方法。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。　　　瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用

25、濾紙反復過濾。,4.7培養(yǎng)基的分裝,培養(yǎng)基的分裝分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2/3在試管內，1/3在試管外。其外還須用防水紙包扎。（目前試管一般多有用螺旋蓋，采用金屬或塑料試管帽）。,分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分

26、裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。　　分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，作為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。,4.8培養(yǎng)基的滅菌,一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后

27、再用無菌操作技術、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。,4.9培養(yǎng)基斜面和平板的制作,瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應垂直放置至冷凝。制作平板培養(yǎng)基時，將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至5

28、0℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中，溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。,平板的制作應在火旁進行，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入10～12mL的培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。,4.10培養(yǎng)基的質量測試,每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分

29、浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。用有關的標準菌株接種1～2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。,4.11培養(yǎng)基的保存,培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培

30、養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽。,§5接種、分離純化培養(yǎng)和菌種保存,5.1接種　　將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內的過程叫做接種。,5.1.1接種工具和方法,,1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀,圖5-1　接種和分離工具,常用的接種方法有以下幾種：,(1)劃線接種 　最常用，工具：接種環(huán)，接種針，在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

31、　　(2)三點接種 在研究霉菌形態(tài)時常用此法。　　(3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。,(4)澆混接種(5)涂布接種(6)液體接種 固體培養(yǎng)基→液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)物→液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)物→固體培養(yǎng)基。(7)注射接種

32、 疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。(8)活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。,5.1.2無菌操作,培養(yǎng)基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。,接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應盡量短。用于接種的器具必須經干熱或火焰

33、等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖5-2）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養(yǎng)皿內倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要

34、接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。,,圖5-2　斜面接種時的無菌操作,(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞,5.2分離純化,含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純

35、化。,5.2.1傾注平板法,首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細胞經過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。,,圖1　傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解,1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無菌水,,,5.2.2涂布平板法,首

36、先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖1 b）,5.2.3平板劃線法,最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖2）當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸

37、稀釋，最后在所劃的線上分散生長，各自形成菌落，以便根據(jù)菌落形態(tài)及特征，挑選單個菌落，經過移種而獲得純種細菌 (純培養(yǎng))。,,圖2　平板劃線分離法,1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,,,,,5.2.4富集培養(yǎng)法,富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，使其能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物?！　∷鶆?chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫

38、受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經過多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。,5.2.5厭氧法,為了分離某些厭氧菌，利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然

39、后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。,5.3培養(yǎng),微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。,5.3.1影響微生物生長的因素,一)營養(yǎng)物濃度 二)溫度 根據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：　　(1)嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10℃－20℃之間　　(2)中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃

40、－45℃之間 　　(3)嗜熱微生物：生長溫度在45℃以上。,三）水分 四）氧氣 (1)需氧微生物 (2)兼性需氧微生物 (3)微量需氧微生物 (4)耐氧微生物 (5)厭氧微生物,5.3.2培養(yǎng)方法,根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為：好氧培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)。,一）好氧菌的培養(yǎng),(1)固體表面培養(yǎng)法 (2)液體培養(yǎng)法,二)厭氧菌的培養(yǎng),(1)深層穿刺培養(yǎng)(2)化學吸氧與深層穿刺相結合 (3)抽氣法,5.4菌種保存,菌種保

41、藏方法很多，但主要是根據(jù)以下原則而設計的：(1)必須選用典型優(yōu)良純培養(yǎng)物進行保藏，并盡量采用其休眠體，如細菌物芽孢，真菌的孢子等進行保藏；(2)創(chuàng)造有利于微生物休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑等；(3)盡量減少傳代次數(shù)。采用以上措施有利于達到長期保藏的目的。,(1)低溫保存,4～5℃左右的凍箱中貯存。一般細菌可保存1～3個月、酵母菌和霉菌可保存2～6個月后，再移種到新配的斜面培養(yǎng)基1次，經適當培養(yǎng)后，再行

42、保藏。 　優(yōu)點是操作簡單，不需特殊設備；　缺點是保藏時間短，菌種經反復轉接后，遺傳性狀易發(fā)生變異，生理活性減退。,斜面保藏法 將菌種轉接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，　待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎　好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中　包藏。 保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、　放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵　母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞　菌兩周傳代一次。 此法

43、優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點　是保藏時間短、易被污染。穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用　膠塞封嚴，置4℃冰箱存放。,礦物油保存,菌種在瓊脂斜面上或在半固體瓊脂試管中生長后，在試管中再加入無菌液體石蠟，覆蓋在培養(yǎng)基上面，這樣就會使菌種和培養(yǎng)基與外界空氣隔離，并可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，管口可用固體石蠟封口，放置低溫保存，至少保存6個月至1年。此法適于保藏霉菌、酵母菌和放線菌。但有些細菌和霉菌如固氮菌

44、、乳桿菌、分枝桿菌和毛霉、根霉等不宜用此法保存。,§6微生物常規(guī)鑒定技術,6.1形態(tài)結構和培養(yǎng)特性觀察 6.1.1微生物的形態(tài)結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)結構上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結構上的不同達到區(qū)別、鑒定微生物的目的。,6.1.2微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。 (1)

45、細菌的培養(yǎng)特征包括以下內容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴散情況。（圖6-1）,(2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的

46、絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。,6.2生理生化試驗,6.2.1適應環(huán)境特性試驗6.2.1.1生長溫度的試驗微生物在一定的溫度范圍內能進行其生命活動。如超出適宜溫度的范圍，便會產生不利影響，各種不同的微

47、生物所需的最適溫度各不相同。因此，一定要掌握好微生物的最適溫度。一般病原菌的最適溫度是37℃，但在10～45℃范圍內均可生長。,6.2.1.2生長pH試驗pH對微生物發(fā)育影響很大。有的細菌能耐酸如乳酸桿菌等；有的細菌能耐堿，如霍亂弧菌在pH9.2能生長。但大多數(shù)微生物的最適pH為7.2～7.6，pH過低或過高，則生長不良或不生長。,6.2.1.3耐鹽性試驗這是一項觀察滲透壓對微生物生長影響的試驗。不同的微生物對鹽的濃度要求不一?；【?/p>

48、屬的細菌除霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌可在無鹽蛋白胨水中生長外，其他弧菌均需要有鹽才能生長。如副溶血弧菌在無鹽培養(yǎng)基中不能生長，含鹽35g/L時生長最好。因此，可以利用含鹽和不含鹽的培養(yǎng)基對細菌進行鑒別。不同濃度的氯化鈉生長試驗，可利用含有不同濃度的氯化鈉肉湯管，例如：無鹽，0.5%，4%，6%，7%，8%，9%，10%。將待檢菌種接種后置36℃培養(yǎng)，觀察生長情況，判定生長的氯化鈉濃度。,6.2.1.4耐熱試驗耐熱試驗是測定微生物對溫度的抵抗力

49、。不同的微生物對熱的抵抗力不同。一般細菌的繁殖體于60～70℃熱水中30min內死亡，在100℃沸水中立即死亡。細菌芽孢對熱抵抗力強，炭疽芽孢在100℃沸水中存活12min。肉毒桿菌芽孢需6h才能死亡。試驗方法：取18～24h肉湯培養(yǎng)物各0.1mL，接種于一系列肉湯管內，分別放在50℃，53℃，56℃，60℃，65℃，70℃，90℃水浴中，隔水加熱10min或30min，取出時立即浸入冷水中冷卻，然后放37℃培養(yǎng)，判定致死的最低溫度和

50、時間。,6.2.2生化反應微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。,一)糖酵解試驗,,圖中②③⑤為產酸管,圖中③⑤管）為產氣陽性,細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別,二)淀粉水解試驗,,某些細菌可以產生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。,,三)V-P試驗,,,

51、某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應,一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別,四)甲基紅（Methyl Red）試驗,,五)靛基質（Imdole）試驗,,,,六)硝酸鹽（Nitrate）還原試驗,,七)明膠（Gelatin）液化試驗,大腸桿菌：陰性（明膠為固態(tài)） 假單胞菌：陽性（明膠被液化）,