同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的生物芯片技術(shù)研究.pdf

1、“民以食為天，食以安為先”，食品安全是關(guān)系世界民生、社會(huì)和諧的重大問題之一。近年來，食品污染日趨嚴(yán)重和頻繁，不僅造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)嚴(yán)重影響人類的身體健康。真菌毒素是其中的一類主要污染物，可以通過污染的糧食或飼料以及該飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物等進(jìn)入食物鏈，間接地進(jìn)入人體內(nèi)，最終造成致癌、致畸、致突變等嚴(yán)重后果。
　　 目前，真菌毒素污染物的分析方法主要包括生物鑒定法、化學(xué)分析法(以薄層色譜法為主)、儀器分析法(以高效液相色譜法、氣相色

2、譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與液相色譜聯(lián)用技術(shù)為主)和免疫分析法(以酶聯(lián)免疫吸附法最為經(jīng)典、應(yīng)用最普遍)等。但是，這些檢測(cè)方法存在靶標(biāo)物單一、樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、所需樣品用量大、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，不能很好地滿足定量分析的需求。因此，建立準(zhǔn)確、高效、快速、高通量同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的方法是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。
　　 本研究以黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)中的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)與M1(Aflat

3、oxin M1，AFM1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)、T-2毒素(T-2 Toxin，T-2)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)幾種典型的真菌毒素污染物為分析對(duì)象，建立了兩種生物芯片檢測(cè)技術(shù)：同時(shí)檢測(cè)六種真菌毒素(AFB1、AFM1、DON、OTA、T-2、ZEN)的高通量蛋白免疫芯片技術(shù)、同時(shí)檢測(cè)玉米和花生中四種真菌毒素(AFB1、DON

4、、T-2、ZEN)的懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)，具體的研究內(nèi)容如下：
　　 1高通量檢測(cè)六種真菌毒素(AFB1、AFM1、DON、OTA、T-2、ZEN)的蛋白免疫芯片技術(shù)
　　 本研究將瓊脂糖芯片作為載體，在點(diǎn)樣濕度為22%-37%、溫度為24-26℃的條件下，以接觸式點(diǎn)樣方式將探針點(diǎn)制于芯片上，使探針通過物理吸附和共價(jià)結(jié)合的作用偶聯(lián)于芯片上。
　　 接著，優(yōu)化了六種真菌毒素完全抗原、單抗的工作濃度，最終確定AFT-BS

5、A、AFM1-BSA、DON-BSA、OTA-OVA、T-2-BSA、ZEN-BSA的最佳工作濃度依次為0.20、0.10、2.00、2.00、0.20、1.00 mg/mL，對(duì)應(yīng)單抗(AFT-Ab、AFM1-Ab、DON-Ab、OTA-Ab、T-2-Ab、ZEN-Ab)的最佳工作濃度依次為1.00、0.50、1.00、0.10、1.00、1.00μg/mL。另外，對(duì)各完全抗原與各單抗的特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：除AFT、AFM1外，其

6、他四種真菌毒素抗原抗體均具有高特異性，而AFT與AFM1之間存在交叉反應(yīng)是因?yàn)閮烧邔儆谕活愇镔|(zhì)，比較后決定用AFT-BSA與AFT-Ab定量檢測(cè)AFB1，用AFM1-BSA與AFM1-Ab定量檢測(cè)AFM1。
　　 繪制出免疫芯片同時(shí)檢測(cè)六種真菌毒素時(shí)各靶標(biāo)物的競(jìng)爭曲線，結(jié)果表明：競(jìng)爭趨勢(shì)明顯，線性決定系數(shù)R2>0.9774，同時(shí)檢測(cè)時(shí)AFB1、AFM1、DON、OTA、T-2和ZEN的線性檢測(cè)范圍依次為0.04-1.69、0.

7、45-3.90、20.20-69.23、35.68-363.18、0.11-1.81和0.08-7.47 ng/mL，達(dá)2-3個(gè)數(shù)量級(jí)；半抑制濃度IC50依次為0.31±0.04、1.49±0.21、34.54±1.30、134.06±11.75、0.49±0.05和1.54±0.22 ng/mL；批內(nèi)變異系數(shù)CV均小于15%。從而初步說明：免疫芯片法可快速、準(zhǔn)確、精確并且高通量定量檢測(cè)六種真菌毒素。另外，該法還可通過雜交信號(hào)掃描后呈現(xiàn)

8、的不同顏色，裸眼半定量檢測(cè)六種真菌毒素。
　　 最后，以自來水為基質(zhì)，利用免疫芯片法對(duì)六種真菌毒素進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果表明：各靶標(biāo)物的加標(biāo)回收率多在80%-120%的范圍內(nèi)，且CV均小于15%。
　　 2同時(shí)檢測(cè)玉米和花生中四種真菌毒素(AFB1、DON、T-2、ZEN)的懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)
　　 首先，采用EDC法將四種真菌毒素完全抗原(AFT-BSA、DON-BSA、T-2-BSA、ZEN-BSA)與羧基化微球進(jìn)

9、行偶聯(lián)，然后建立了單組份懸浮芯片技術(shù)，包括各真菌毒素單抗與二抗工作濃度的棋盤優(yōu)化、繪制單通道競(jìng)爭標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：各單通道標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均高于0.9953，AFB1、AFM1、DON、T-2、ZEN檢測(cè)區(qū)間分別為0.001-0.20、0.02-13.10、0.27-11.85、0.03-0.33、0.02-0.26 ng/mL，為1-2個(gè)數(shù)量級(jí)；五種真菌毒素AFB1、AFM1、DON、T-2、ZEN的IC50分別為0.02±0.002

10、、0.48±0.065、2.21±0.294、0.12±0.003、0.06±0.002 ng/mL，最低檢出限LOD依次為0.05、4.94、107.50、11.58、29.78pg/mL；CV小于15%。
　　 其次，建立了多組份的懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化了檢測(cè)條件，包括對(duì)各真菌毒素單抗與二抗工作濃度的同時(shí)棋盤優(yōu)化、各完全抗原與單抗的特異性檢測(cè)、試劑加入方式的優(yōu)化和多通道競(jìng)爭標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果表明：多通道標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2>0.

11、9819，四種真菌毒素AFB1、DON、T-2、ZEN檢測(cè)區(qū)間依次為0.04-380.24、0.44-3251.17、0.01-10.91和0.05-84.76 ng/mL，為3-4個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)于單通道檢測(cè)；LOD依次為0.22±0.03、32.91±3.16、0.79±0.11和11.29±1.15pg/mL；CV均小于15%。
　　 再次，建立了同時(shí)檢測(cè)玉米和花生中四種真菌毒素的懸浮芯片技術(shù)，包括實(shí)際樣品前處理方法的探索、實(shí)

12、際樣品中同時(shí)檢測(cè)四種靶標(biāo)物競(jìng)爭標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果顯示：經(jīng)甲醇/水溶液簡單提取后，多通道標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2>0.9804，玉米樣品中AFB1、DON、T-2、ZEN的線性檢測(cè)范圍依次為0.07-593.31、0.71-1525.29、0.01-9.56和0.02-55.35 ng/g，花生樣品中的依次為0.04-252.65、0.16-2283.88、0.01-11.02和0.18-35.72 ng/g，可達(dá)3-4個(gè)數(shù)量級(jí)；玉米樣品中LOD

13、依次為0.42±0.06、193.09±13.57、0.50±0.05和0.45±0.05 pg/g，花生樣品中的LOD依次為0.64±0.09、3.73±0.36、0.32±0.04和76.97±10.53 pg/g；CV均小于15%。
　　 最后，與國標(biāo)中的HPLC進(jìn)行方法比對(duì)研究，包括四種靶標(biāo)物HPLC法的建立、方法準(zhǔn)確度和精確性的驗(yàn)證，結(jié)果顯示：HPLC和懸浮芯片法在玉米和花生兩種實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率分別為85.11%