第二章動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)

1、第二章 動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫技術(shù),細(xì)菌 病毒 真菌 病原性微生物： 立克次氏體 寄生蟲

2、 昆蟲 采集 運(yùn)送 檢驗(yàn)檢疫技術(shù) 處理 保存方法,第一節(jié) 檢驗(yàn)檢疫樣品第二節(jié) 細(xì)菌分離及鑒定第三節(jié) 病毒分離及鑒定第

3、四節(jié) 其他病原微生物分離及鑒定第五節(jié) 寄生蟲檢查第六節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用,第一節(jié) 檢驗(yàn)檢疫樣品一、病料采集和運(yùn)送二、病料的保存三、病料的記錄、包裝和運(yùn)送方法1、在采取病料前必須對(duì)被檢動(dòng)物可能患有何種疫病作出初步診斷。2、采取病料所用的容器、手術(shù)器械，均應(yīng)滅菌后才能使用，采樣時(shí)應(yīng)無菌操作。3、解剖前檢查：凡是急性死亡的動(dòng)物，沒解剖之前，必須用顯微鏡檢查其血液抹片或組織觸片當(dāng)中是否有炭疽桿菌。如果懷疑是炭

4、疽，不能隨意解剖，可采取血液檢查。只有在確定不是炭疽后，方可進(jìn)行剖檢。解剖時(shí)，采取有病變的臟器或者組織送往實(shí)驗(yàn)室，以便證明其病因。,4、取材的時(shí)間要早：動(dòng)物死亡之后，要立即采取相關(guān)病料，最好不要超過6h，否則時(shí)間過長(zhǎng)，由于腸內(nèi)其他細(xì)菌侵入，致使尸體容易腐敗，不利于病原菌的檢出5、為了提高病原微生物的陽性分離率，采取病料的種類，應(yīng)根據(jù)不同的疫病，相應(yīng)的采取其臟器或內(nèi)容物。在無法估計(jì)是某種疫病時(shí)，可進(jìn)行全面的采取。,二、病料的保存（一）

5、細(xì)菌檢驗(yàn)材料的保存 將采取的臟器組織塊，保存于飽和的氯化鈉溶液或30%甘油緩沖鹽水溶液中，容器加塞封固。液體裝在封閉的毛細(xì)玻管或試管運(yùn)送。（二）病毒檢驗(yàn)材料的保存 將采取的臟器組織塊，保存于50%甘油緩沖鹽水溶液或雞蛋生理鹽水中，容器加蓋封固。（三）病理組織學(xué)檢驗(yàn)材料的保存 將采取的臟器組織塊放入10%福爾馬林溶液或95%酒精中固定；固定液的用量為送檢材料的10倍以上，起碼要淹沒住。如用10%福爾馬林溶液固定

6、，應(yīng)在24h后換新鮮溶液一次。嚴(yán)冬季節(jié)為防止病料凍結(jié)，把固定好的組織塊取出，保存于甘油和10%福爾馬林等量混合液中。,三、病料的記錄、包裝和運(yùn)送方法（一）送檢單 病料送往檢驗(yàn)室時(shí)，要附送病料送檢單，該單需復(fù)寫3份，其中1份存根，兩份寄往檢驗(yàn)室，等檢查完畢后，退回1份。（二）病料的包裝和運(yùn)送 1、液體病料最好收集在滅菌的細(xì)玻璃管中，管口用火焰封閉，封閉時(shí)，要注意不能使管內(nèi)的病料受熱。然后將封閉的玻管用廢報(bào)紙或棉花包裹

7、，裝入大一號(hào)的試管中，再裝入木盒中運(yùn)送。,2、盛放組織或臟器的玻璃儀器，包裝時(shí)要細(xì)致結(jié)實(shí)，最好是容器套容器。就是里面的小容器加塞封口，外面的大容器內(nèi)部襯墊廢紙之類的材料，這樣不至于使里面的小容器破碎。氣候炎熱時(shí)，就需要加冰塊物理降溫，但是也不能使病料凍結(jié)。 3、病料裝好后，要盡快送到檢驗(yàn)部門。途中要避免病料接觸高溫及日光。,第二節(jié) 細(xì)菌分離及鑒定 細(xì)菌分離及鑒定就是采用人工的方法使細(xì)菌在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)繁殖，

8、獲取純種、進(jìn)行鑒定與研究等的過程。一、無菌技術(shù)無菌技術(shù)操作要點(diǎn)：（1）無菌室在使用前，先用紫外燈照射30~60min進(jìn)行空氣消毒。（2）在進(jìn)行接種、傾注瓊脂平板時(shí)均須在無菌室、超凈工作臺(tái)或接種罩內(nèi)操作。（3）用接種環(huán)分離和移種細(xì)菌時(shí)，使用前后均需采用火焰滅菌。,（4）凡是打開或關(guān)閉無菌試管和燒瓶時(shí)，管口要通過火焰2~3次，用來殺滅可能吸附在管口或瓶口的細(xì)菌。開啟后的試管和燒瓶應(yīng)盡量靠近火焰，而且要求瓶口千萬不要向上和長(zhǎng)時(shí)間暴漏

9、在空氣中。操作時(shí)，千萬不能造成含菌材料污染臺(tái)面和其他物體。 （5）所用的物品都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，在使用過程中不得與未經(jīng)滅菌的物品接觸。 （6）從動(dòng)物體內(nèi)抽血或接種時(shí)，要先剪去局部毛后，再進(jìn)行常規(guī)消毒。 （7）工作完畢，室內(nèi)空氣用紫外燈照射30min、實(shí)驗(yàn)人員認(rèn)真消毒洗手。 （8）如果不慎造成污染，要及時(shí)用消毒液處理。,二、接種工具 接種環(huán) 接種工

10、具 接種針 耙形接種針的針尖部分 刀形 鋤形,滅菌程序：手持接種工具的絕緣端，將鎳絲直立在火焰上逐漸向下移動(dòng)，把工具燒紅，再平持工具，將金屬柄往返在火焰中通過3次滅菌，冷卻使用。 用完后，立即將染菌的鎳絲在火焰（內(nèi)焰）中加熱，烤干環(huán)（針）端附著的細(xì)菌或標(biāo)

11、本，然后再移入火焰中灼燒滅菌，最后將金屬柄在火焰中往返通過3次。如果直接將環(huán)（針）在火焰中燃燒，則有污染環(huán)境或感染的危險(xiǎn)。,三、操作環(huán)境（一）接種罩 供接種（或轉(zhuǎn)種）細(xì)菌用的玻璃或有機(jī)玻璃制成的空間，它的樣式可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)和選擇。接種罩在使用之前，要先用消毒劑擦拭，或用紫外燈照30min。操作結(jié)束后，也應(yīng)立即清理內(nèi)部，并作消毒處理。（二）無菌工作臺(tái) 也叫超凈工作臺(tái)或生物安全柜，是在接種罩的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出來的一種無菌

12、空間。（三）無菌室 無菌室是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安裝的用于無菌操作的小室。無菌室內(nèi)應(yīng)有空氣過濾裝置、紫外線燈、照明燈、電源燈設(shè)施。無菌室內(nèi)需保持整潔，進(jìn)入無菌室，要穿隔離衣帽和專用鞋，用前需紫外燈照射30~60min消毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要擦拭干凈臺(tái)面、地面，紫外燈照射消毒，使無菌室保持無菌狀態(tài)。,第三節(jié) 病毒分離及鑒定一、檢材的采集與送檢冰塊 干冰病變組織——50%的甘油緩沖鹽水二、病料的處理 將分離病毒的材料制成1:5

13、~1:10的乳劑，并且每1mL加入青霉素和鏈霉素各1000單位，主要目的是抑制可能污染的細(xì)菌，然后放置冰箱中2~4h，再進(jìn)行離心沉淀，取上清液作為接種材料。,三、病毒的分離培養(yǎng) 病毒本身沒有完整的生物合成酶系統(tǒng)，只能依靠宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)與營(yíng)養(yǎng)才能繁殖，因此，培養(yǎng)病毒需要接種動(dòng)物、雞胚或者組織細(xì)胞。（一）動(dòng)物接種培養(yǎng) 動(dòng)物接種場(chǎng)地的選擇→實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類→動(dòng)物選擇→常用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)（二）病毒的雞胚培養(yǎng) 雞胚是正

14、在發(fā)育的活的機(jī)體，組織分化程度低，細(xì)胞代謝旺盛，適用于許多人類和動(dòng)物病毒的生長(zhǎng)繁殖。 雞胚的選擇和孵育→接種前的準(zhǔn)備→雞胚接種→接種后的檢查→雞胚材料的收獲,（三）病毒的細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)——通過機(jī)械解離或消化等方法將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長(zhǎng)于繁殖，稱為細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞的培養(yǎng)——用胰蛋白酶將人胚（或動(dòng)物）

15、組織分散成單細(xì)胞，加一定培養(yǎng)液，370C孵育1~2d后逐漸在培養(yǎng)瓶底部長(zhǎng)成單層細(xì)胞。傳代細(xì)胞培養(yǎng)——是指需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)的過程。病料處理→病毒分離、繁殖→細(xì)胞病變（CPE）觀察,第四節(jié) 其他病原微生物分離及鑒定一、螺旋體 螺旋體是一類菌體細(xì)長(zhǎng)、柔軟、彎曲呈螺旋狀、能活潑運(yùn)動(dòng)的原核單細(xì)胞微生物。二、立克次氏體 立克次氏體是介于細(xì)菌和病毒之間的一類微生物。除

16、少數(shù)成員外，大多數(shù)為嚴(yán)格的細(xì)胞外寄生性微生物。三、支原體 支原體是能在無活細(xì)胞培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物，它是一類無細(xì)胞壁，僅由三層薄膜組成的細(xì)胞膜，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀核糖體，雙股DNA的原核細(xì)胞。四、衣原體 衣原體是一類專性嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生活的微生物，不能在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。,第五節(jié) 寄生蟲檢查一、蟲卵檢查法 蟲卵漂浮法——相對(duì)密度較小的蟲卵，根據(jù)蟲卵的相對(duì)密度，配制相應(yīng)的漂浮液，掌握適當(dāng)?shù)碾x心力進(jìn)行離

17、心，即可以在漂浮液的液面上收集到蟲卵。 用水洗沉淀法——對(duì)相對(duì)密度較大的蟲卵，多用水洗沉淀法，在沉渣中收集檢查蟲卵。,二、蟲體檢查法 1、蠕蟲的成蟲檢查法：成蟲的蟲體檢查，在生前主要用于絳蟲病的診斷；死后剖檢（或抽樣剖檢）幾乎可用于所有蠕蟲病的檢查。 2、蠕蟲的幼蟲檢查法：幼蟲的蟲體檢查，多用于非腸道寄生蟲或通過蟲卵不易鑒定寄生蟲。如貝爾曼氏幼蟲檢查法用于檢查肺線蟲；血液壓片法和集蟲檢查法用于檢查絲狀線蟲病。

18、3、螨蟲檢查法：分皮屑內(nèi)死蟲檢查法和皮屑內(nèi)活蟲檢查法。前者可采用漂浮法或沉淀法，適用于初步診斷；后者可采用直接檢查法或溫水檢查法，適用于確診。,三、免疫學(xué)檢測(cè)方法1、免疫沉淀技術(shù)：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、免疫電泳法等；2、免疫熒光技術(shù)：結(jié)合了免疫學(xué)反應(yīng)的特異性和在黑色背景中發(fā)光物質(zhì)易被發(fā)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)；3、免疫酶技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）；4、免疫凝集技術(shù)：間接的細(xì)胞凝集試驗(yàn)（

19、IHA）、乳膠凝集試驗(yàn)等。,四、分子生物學(xué)檢測(cè)方法 主要用于精確的定性分析或衡量病原的檢測(cè)，包括核酸探針技術(shù)和PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)。這兩種技術(shù)在寄生蟲的檢測(cè)中多局限于同一種屬中不同蟲種或蟲株的鑒別。,第六節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用 抗原-抗體反應(yīng)的免疫血清學(xué)技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù) 病原核酸檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù) 免疫血清

20、學(xué)技術(shù)——中和試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫酶標(biāo)記技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)等。,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 核酸雜交 寡核苷酸指紋圖譜分子生物學(xué)技術(shù) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

21、 DNA序列測(cè)定 DNA芯片 其中PCR和核酸雜交技術(shù)具有特異、敏感、快速、適于疫病早期診斷和大量樣品的檢測(cè)而成為分子生物學(xué)診斷技術(shù)中最常用和最具應(yīng)用價(jià)值的方法。,二、免疫學(xué)技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用（一）病原菌的檢測(cè) 常規(guī)細(xì)菌疫病的診斷和檢疫方法——細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌落培養(yǎng) 特性、菌體染色鏡檢、生化試驗(yàn)。優(yōu)點(diǎn)：快速、又靈敏，不但可以直接進(jìn)行細(xì)菌菌種的鑒定，而且

22、可鑒定種內(nèi)的血清型和血清亞型，成為檢疫動(dòng)物細(xì)菌疫病的主導(dǎo)方法。缺點(diǎn)：交叉反應(yīng)較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低，所以不能直接對(duì)這些樣品進(jìn)行分析和檢測(cè)，檢測(cè)前需進(jìn)行富集培養(yǎng)，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。,（二）藥物殘留的檢測(cè) 抗生素（青霉素、慶大霉） 磺胺類（磺胺甲惡唑（SMZ））殘留藥物 呋喃類（呋喃唑酮（痢特靈）、 喹諾酮類（諾氟

23、沙星） 激素（性激素、胰島素） 轉(zhuǎn)基因類藥物 目前用的最多的方法就是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定），它前處理簡(jiǎn)單，可同時(shí)分析多個(gè)樣品，分析時(shí)間短，靈敏度高，因此是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。,三、分子生物學(xué)技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用（一）應(yīng)用于病原細(xì)菌的檢測(cè) 主要應(yīng)用的有兩種方法，一是PCR，另一種是核酸探針技術(shù)。PCR優(yōu)點(diǎn)：不僅檢測(cè)時(shí)間

24、短、靈敏度高，還可以檢出一些依靠培養(yǎng)法不能檢測(cè)的微生物種類。該技術(shù)已用于病原菌的檢測(cè)，如大腸桿菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌等的鑒定和分型中，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測(cè)任何的病原體。 核酸探針技術(shù)也已應(yīng)用于檢測(cè)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等的。缺點(diǎn)：檢測(cè)一種菌就需要制備一種探針；要達(dá)到檢測(cè)量還要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)；探針檢測(cè)是分析基因序列，對(duì)毒素污染的樣品有時(shí)因?yàn)闃悠分胁缓舅囟鵁o法檢測(cè)。,（二）在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用