（ngs）dna序列分析技術(shù)-thermofisherscientific

1、,孫宏鈺中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系,法庭科學(xué)新技術(shù)應(yīng)用高峰論壇（2016年11月17日佛山）,NGS-STR分型在個(gè)體識(shí)別和親子鑒定中的應(yīng)用初探,前 言,,Part I,,基于CE平臺(tái)的PCR-STR檢測(cè)是現(xiàn)階段法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室的金標(biāo)準(zhǔn)Forensic DNA CaseworkDNA DatabasesMass DisastersMissing PersonsParentage and Kinship Testing

2、Genetic Genealogy & Answering Historical QuestionsAuthenticating Human Cell LinesMonitoring Transplants……更多Loci組合的有限性長度多態(tài)性檢測(cè)：未充分利用遺傳標(biāo)記信息,法醫(yī)STR分型,,,中國法庭DNA數(shù)據(jù)庫已有3877.1（4400）萬條數(shù)據(jù)已認(rèn)定比中391.9萬次現(xiàn)場(chǎng)生物物證入庫比中率35.34%,,,DN

3、A序列分析技術(shù)—下一代測(cè)序（NGS）,DNA序列分析技術(shù)—下一代測(cè)序（NGS）,,,,Massively parallel sequencing (MPS),DNA序列分析技術(shù)—下一代測(cè)序（NGS）,,,,,,基于NGS平臺(tái)的法醫(yī)STR分型,,,長度多態(tài)性 序列多態(tài)性,,材料和方法,,Part II,實(shí)驗(yàn)材料,,,樣本：42個(gè)廣東漢族個(gè)體血痕樣本（3.0mm血

4、片）包含14個(gè)父母子二代家系已采用Goldeye 20A體系進(jìn)行19個(gè)STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)，每個(gè)家系都包含1～2個(gè)STR突變位點(diǎn)陽性對(duì)照：007 (Thermo Fisher)9947A (Promega),實(shí)驗(yàn)方法,,,DNA提?。篈utoMate ExpressTM自動(dòng)化提取系統(tǒng)PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction KitQubit®

5、;3.0定量 DNA濃度,實(shí)驗(yàn)方法,,,文庫構(gòu)建：樣本文庫構(gòu)建Early Access STR Kit （24個(gè)STR基因座）11個(gè)CODIS核心位點(diǎn)： CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D21S11, TH01, TPOX, vWA5個(gè)CODIS補(bǔ)充核心位點(diǎn)： D1S1656, D2S1338, D2S441, D10S1248, D19S4

6、338個(gè)非CODIS核心位點(diǎn)： D14S1434, D1S1677, D2S1776, D4S2408, D5S2500, D6S1043, D6S474, D9S2157樣本文庫純化磁珠 Agencourt® AMPure® XP Reagent (Beckman Coulter),實(shí)驗(yàn)方法,,,模板制備：文庫定量 qPCR定量到40-60pM乳化PCR Ion PGM? Hi?Q? Chef K

7、it（Thermo Fisher）陽性珠子的富集,Ion Chef,實(shí)驗(yàn)方法,,,測(cè)序反應(yīng)：半導(dǎo)體測(cè)序ION PGM? Hi-Q? Sequencing Kit（Thermo Fisher）Ion 318? 芯片：1GIon 316? 芯片：100M,Ion PGM,通過檢測(cè)pH值變化來進(jìn)行測(cè)序，直接將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。,實(shí)驗(yàn)方法,,,數(shù)據(jù)分析：PGM測(cè)序數(shù)據(jù)分析HID STR Genotyper Plugin v3.

8、1 BAM 文件用IGV_2.3.72分析FASTQ文件用STRait Razor v2.6分析PGM分型數(shù)據(jù)和CE分型數(shù)據(jù)比較PGM家系數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論,,Part III,分型結(jié)果,NGS-STR基因座分型,,,,所有樣本的分型結(jié)果總覽,,,等位基因的核心序列簡式,等位基因及其Stutter峰圖,分型結(jié)果輸出格式,NGS-STR基因座分型,,,分型結(jié)果輸出格式,NGS-STR基因座分型,,,PGM檢測(cè)平臺(tái)的STR

9、基因座分型,,,陽性對(duì)照結(jié)果,測(cè)序覆蓋深度（ depth of coverage, DoC）,NGS-STR檢測(cè)的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,PGM檢測(cè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,Stutter占主峰的峰面積比：,Stutter出現(xiàn)比率：,等位基因的雜合峰高比,PGM檢測(cè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,CE和NGS平臺(tái)的STR分型一致性：42個(gè)樣本和2個(gè)陽性對(duì)照DNA樣本（9947A，007），共1232個(gè)等位基因，分型一致率為98.13%。不一致原因分析等位基

10、因丟失D21S11基因座X.1、X.2、X.3結(jié)構(gòu)多一個(gè)重復(fù)單位,,,各個(gè)基因座的等位基因個(gè)數(shù),等位基因（Isoallele）,,,,,等位基因（Isoallele）,,Goldeneye 20A和Early Access STR Kit重疊基因座共14個(gè)：CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D6S1043, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D19S433, D

11、21S11, TH01, TPOX and vWA14個(gè)三聯(lián)體二代家系：3個(gè)：母源突變（其中2個(gè)是多步突變）3個(gè)：父源突變3個(gè)：突變來源不明3個(gè)：有突變，但未涵蓋在重合的14個(gè)基因座中,親子鑒定,,,,小 結(jié),,Part IV,NGS-STR分型的優(yōu)點(diǎn),,,,檢測(cè)序列多態(tài)性——信息更充分利用，提高多態(tài)性；可組合的STR基因座的個(gè)數(shù)不受熒光種類限制；每個(gè)STR基因座的擴(kuò)增片段長度不受熒光組合限制；對(duì)等位基因親本來源的識(shí)別