玉米DNA誘導(dǎo)的13種水稻突變體特異序列分析.pdf

1、利用外源DNA誘導(dǎo)水稻發(fā)生變異，已成為創(chuàng)制水稻新種質(zhì)和新品種的重要途徑之一，但對(duì)其誘變的內(nèi)在機(jī)制還不甚了解。本研究室用改良的“花粉管通道法”將玉米基因組DNA片段直接導(dǎo)入受體水稻“日本晴”中，獲得一批具有多種表型變異的突變體材料。本研究選取13個(gè)具有特殊表型變異的突變體(V1～V13)作為實(shí)驗(yàn)材料，采用AFLP方法對(duì)其進(jìn)行多態(tài)性分析，并對(duì)擴(kuò)增得到特異條帶進(jìn)行序列分析，旨在從分子水平揭示外源DNA導(dǎo)入對(duì)受體基因組DNA的影響，并分析這種D

2、NA水平的變化對(duì)基因功能的影響，為外源DNA誘導(dǎo)水稻發(fā)生變異提供依據(jù)。
　　首先，對(duì)選定的64對(duì)AFLP選擴(kuò)引物進(jìn)行篩選，從中優(yōu)化出27對(duì)多態(tài)性好的引物，然后用優(yōu)化的選擴(kuò)引物對(duì)13種水稻突變體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共得到64條特異帶和98條缺失帶，說(shuō)明外源玉米DNA導(dǎo)入可引起受體水稻DNA多態(tài)性發(fā)生改變。
　　對(duì)上述64條特異帶進(jìn)行回收純化、克隆和測(cè)序，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:1、64條特異序列測(cè)序共得到15185個(gè)

3、堿基，有591個(gè)堿基發(fā)生突變，堿基總突變率為3.89％，說(shuō)明外源玉米DNA導(dǎo)入可誘導(dǎo)受體水稻發(fā)生堿基突變，且具有較高的誘變效應(yīng)。2、特異條帶的產(chǎn)生是由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的堿基發(fā)生突變，或（和）與之相鄰選擇性堿基發(fā)生突變，或（和）DNA片段的插入或缺失所致，說(shuō)明外源DNA的導(dǎo)入既能引起受體水稻基因組中的個(gè)別堿基發(fā)生突變，又能導(dǎo)致DNA片段的插入和缺失。3、在堿基突變類型中，發(fā)生堿基置換的頻率(45.52％)＞堿基插入(28.44％)＞

4、堿基缺失(25.04％)，且堿基置換主要為單堿基突變，堿基插入與缺失偏向于發(fā)生連續(xù)多個(gè)堿基。說(shuō)明將外源玉米DNA片段導(dǎo)入水稻，在誘導(dǎo)產(chǎn)生的堿基突變類型中，以堿基置換為主。4、在284處堿基突變中，單堿基突變241處，雙堿基突變18處，連續(xù)三堿基突變4處，連續(xù)多堿基突變21處，發(fā)生單堿基突變的頻率(84.86％)顯著高于雙堿基突變(6.34％)、連續(xù)三堿基突變(1.41％)和連續(xù)多堿基突變(7.39％)。說(shuō)明將外源玉米DNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的堿基

5、突變主要為單堿基突變。5、在堿基置換中，發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率(65.80％)顯著高于顛換(34.20％)，說(shuō)明在堿基置換中，易于發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換。6、通過(guò)對(duì)突變位點(diǎn)的鄰側(cè)堿基分析，發(fā)現(xiàn)16種鄰側(cè)堿基類型的發(fā)生頻率從高到低依次為:ANT(9.86％)＞CNG(8.80％)＞ANG(8.45％)＞CNT(7.75％)＞TNT(7.39％)=CNA(7.39％)＞ANA(7.04％)＞GNC(6.34％)＞TNG(5.99％)＞CNC(4.93％)=T

6、NC(4.93％)=TNA(4.93％)=GNT(4.93％)＞GNA(4.23％)＞GNG(3.52％)=ANC(3.52％)，相對(duì)而言，鄰側(cè)堿基為ANG、ANT、CNG較易發(fā)生堿基突變;GNG、ANC較不易發(fā)生堿基突變。7、在241處單堿基突變中，轉(zhuǎn)換157處，顛換76處，發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換的頻率(65.15％)顯著高于顛換(31.54％)。8).64條特異序列中，有18條特異序列的堿基突變發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼序列上，其中發(fā)生同義突變有20處