儀器分析選論酶免疫分析技術(shù)

1、,16.5.2酶免疫分析技術(shù),應(yīng)化1305宋宇韡 33,2,酶免疫技術(shù)的分類,克隆酶供體免疫測(cè)定,酶免疫分析技術(shù),,酶免疫組織化學(xué)技術(shù),酶免疫測(cè)定技術(shù),,均相酶免疫測(cè)定,異相酶免疫測(cè)定,,,酶放大免疫測(cè)定技術(shù),液相酶免疫測(cè)定,固相酶免疫測(cè)定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位分析,液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量,一、均相酶免疫測(cè)定法,酶蛋白與抗原或抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記物。 未與抗原（抗體）結(jié)合的標(biāo)

2、記抗體（抗原），稱為游離標(biāo)記物。 與抗原（抗體）結(jié)合的標(biāo)記抗體（抗原），稱為結(jié)合標(biāo)記物。,一、均相酶免疫測(cè)定法,基本原理 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，其中的酶活性將發(fā)生改變。,因此，不需對(duì)反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離，直接測(cè)定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性的變化即可推算出被測(cè)樣品中抗原的含量。,二、非均相酶免疫測(cè)定法,基本原理：抗原抗體反應(yīng)平衡后，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物，然后對(duì)經(jīng)酶催化的底物顯色程度進(jìn)行測(cè)定，再

3、推算待測(cè)樣品中抗原（或抗體）的含量。依據(jù)測(cè)定方法又可分為液相和固相酶免疫測(cè)定。目前臨床上多用固相酶免疫測(cè)定法。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,一、基本原理,,,,底物顯色定性或定量的分析,包被將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面,反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體,洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,方法類型及反應(yīng)原理,（一）檢測(cè)抗原的方法,將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與

4、固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。,1.雙抗體夾心法,雙抗體夾心法檢測(cè)抗原,適用于檢測(cè)含有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原,（1）將已知抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。 （2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。 （3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的 定性或定量。,2．技術(shù)要點(diǎn),,,底物,,（

5、+）,雙抗體夾心法測(cè)抗原,2.雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原,即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測(cè)定。,雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原,在包被時(shí)使用一種單抗，酶標(biāo)記時(shí)使用一種單抗,,,3.加酶作用的底物顯色,2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體,1.已知抗體包 被載體,,,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E

6、,Y,Y,,Y,E,Y,,,Y,E,Y,Y,（+）,,3.加酶作用的底物不顯色,2.加待檢物（無(wú)抗原）和酶標(biāo)抗體,1.已知抗體包 被載體,,,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（-）,,Y,Y,Y,,雙位點(diǎn)一步法測(cè)抗原,如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過(guò)高， 容易形成“鉤狀效應(yīng)（hook effect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。,注意事項(xiàng),,E,,,,,,底物,固相抗體,標(biāo)本（抗原濃度

7、高）,酶標(biāo)抗體,,,3.競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原,酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。,酶標(biāo)抗原,,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原,（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。 （2）待測(cè)管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如

8、果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對(duì)照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。 （3）加底物顯色。對(duì)照管中顏色深，待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。,技術(shù)要點(diǎn),競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,（二）檢測(cè)抗體的方法,將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。,1

9、.間接法,,間接法檢測(cè)抗體,酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白(如抗人IgG），因此該法只需要變換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣的通用性,間接法測(cè)抗體,2.雙抗原夾心法,將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。,同雙抗體夾心法。,技術(shù)要點(diǎn),,雙抗原夾心法檢測(cè)抗體,4.加酶作用的底物 不顯色,

10、雙抗原夾心法測(cè)抗體,3.競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體,同競(jìng)爭(zhēng)法結(jié)合抗原。,HBcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法，但其測(cè)定具體模式有區(qū)別。,1．原理,（1）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測(cè)定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。,2．技術(shù)要點(diǎn),,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb,3.加酶作用的底物顯色,,,3.加酶作用的底物

11、顯色,2.加待檢抗體 和酶標(biāo)抗體,1.已知HBcAg包 被載體,,,（+）,,,,Y,,,Y,,,Y,,Y,,Y,,E,,,2.加待檢物（無(wú)抗體）和酶標(biāo)抗體,1.已知HBcAg包 被載體,,,（-）,,,,Y,,Y,,Y,,E,,Y,,Y,,Y,,E,E,E,E,E,,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb,（2）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HB

12、eAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測(cè)定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb,,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb,方法評(píng)價(jià),ELISA具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣泛、無(wú)反射性同位素污染等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)展最快、應(yīng)用最廣，普及。,1．病原體及其抗體測(cè)定 廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2．蛋白質(zhì)測(cè)定 各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶

13、等。3．藥物和毒品測(cè)定 如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。,酶免疫測(cè)定的應(yīng)用,酶增強(qiáng)免疫測(cè)定技術(shù)EMIT,將半抗原（或小分子抗原）與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，采用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定半抗原，即樣品中待測(cè)半抗原復(fù)合物和酶標(biāo)半抗原與相應(yīng)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成待測(cè)半抗原復(fù)合物和酶標(biāo)半抗原復(fù)合物。,原理,當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，抗體與所標(biāo)記的酶密切接觸，使酶的活性中心不受影響，其活性得以發(fā)揮，通過(guò)加底物測(cè)定反應(yīng)系統(tǒng)中酶活性。待測(cè)半抗原含量與酶活性成正比，

14、即待測(cè)半抗原越多，酶活性越高。通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中半抗原的含量。該技術(shù)主要用于檢測(cè)小分子或半抗原，在藥物檢測(cè)中應(yīng)用最多。,克隆酶供體免疫測(cè)定技術(shù)CEDIA,克隆酶供體免疫測(cè)定技術(shù)（CEDIA）是利用充值DNA技術(shù)，制備β半乳糖苷的兩個(gè)片段；羧基端的大片段稱為酶受體（enzyme acceptor，EA），氨基端的小片段稱為酶供體（enzyme donor，ED）。這兩個(gè)片段本身均無(wú)酶活性，但EA和ED可以聚合成具有活性的酶。