多菌靈酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究.pdf

1、鑒于我國有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的大量應(yīng)用，蔬果中農(nóng)藥殘留超標(biāo)不容忽視。為了滿足我國農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)場和快速檢測的需要，選取應(yīng)用廣泛、具有廣譜殺蟲效果和具有代表性的氨基甲酸酯類農(nóng)藥—多菌靈作為研究對象，根據(jù)酶聯(lián)免疫分析的原理，試圖建立快速、低成本、適宜于現(xiàn)場檢測的多菌靈殘留的酶聯(lián)免疫快速檢測技術(shù)，為進(jìn)一步研制ELISA試劑盒及其工藝流程定型提供基礎(chǔ)，也將為蔬果中農(nóng)藥殘留的快速、現(xiàn)場檢測和監(jiān)控提供技術(shù)支撐。 多菌靈，通用名carbenda

2、zim，分子式：C9H9N3O2，化學(xué)名稱O-甲基-N-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(Methyl3H-benzoimidazol-2-ylaminoformate)，與苯菌靈等具有相似的特異結(jié)構(gòu)—苯并咪唑，與托布津、甲基托布津的代謝物結(jié)構(gòu)相同。本研究設(shè)計(jì)了兩條多菌靈半抗原的合成路線。其一，活化苯并咪唑環(huán)上的亞氨基，使之帶上可以利用的羥基，合成半抗原-1-氧羰乙基丙酸-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯，多菌靈中的苯并咪唑環(huán)和氨基甲酸甲酯部分均被保留；

3、其二，多菌靈原藥在堿性條件下水解，生成2-氨基苯并咪唑氨基甲酸甲酯，再經(jīng)琥珀?；?，得到半抗原-2-琥珀酰苯并咪唑。合成的兩種半抗原經(jīng)核磁共振和紅外鑒定，證明合成成功。分別采用混合酸酐法、活性酯法使兩種半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備了免疫原MBC-BSA和包被原MBC-OVA，偶聯(lián)比均在3-35：1之間，符合小分子免疫的要求。經(jīng)過免疫得到了抗血清，但是第一種免疫原的抗血清效價(jià)較低，不滿足ELISA方法的要求。而第二種免疫原制備的多克隆抗體，效價(jià)在

4、64000以上，同時(shí)除了與苯菌靈具有很高的交叉率、與噻苯達(dá)唑交叉率達(dá)到8％外，與托布津、甲基托布津等其它農(nóng)藥的交叉率均小于2％，符合ELISA分析技術(shù)建立對抗血清效價(jià)的要求，并用辛酸一硫酸銨鹽析法對抗血清進(jìn)行純化。 本研究從包被條件與方法選擇、抗體(抗血清)工作濃度優(yōu)化和基質(zhì)條件優(yōu)化(鹽濃度、pH值和樣品溶劑)等方面初步得到間接ELISA分析的最佳工作條件，并在優(yōu)化條件下建立多菌靈檢測的間接ELISA法，抑制率與多菌靈的濃度對

5、數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，符合回歸方程Y=11.832Ln(x)+57.366，回歸系數(shù)R2=0.9989**，測定范圍0.05ng/L-15ng/L，最低檢測限0.05ng/mL，在10％的甲醇提取中的添加回收率平均為109％，變異系數(shù)6.2-16％，初步鑒定滿足多菌靈的實(shí)際檢測需求。 采用多菌靈間接ELISA法對結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。當(dāng)多菌靈對抗體抗原反應(yīng)的抑制率為50％時(shí)，所需多菌靈的濃度為4.0ng/g，苯菌靈的濃度

6、為4.0ng/g，噻苯達(dá)唑濃度為30ng/g，交叉反應(yīng)率為8％，甲基托布津、托布津濃度均大于200ng/g，交叉反應(yīng)率為小于2％，2-氨基苯并咪唑濃度大于500ng/g，交叉反應(yīng)率小于0.8％。此法可以用于苯菌靈及其代謝物多菌靈的檢測，但是如何區(qū)分苯菌靈和多菌靈殘留尚需進(jìn)一步研究。 以建立的ELISA檢測方法對來自土壤和水中的添加樣品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，并與常規(guī)的HPLC分析進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，間接ELISA法測定土壤中多菌靈的添加回收率