Bt蛋白酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因作物由于具有抗蟲(chóng)害、抗除草劑等優(yōu)良品質(zhì),目前在一些國(guó)家已大規(guī)模商品化生產(chǎn).隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性認(rèn)識(shí)的不斷深入,各國(guó)在積極發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí),加強(qiáng)了對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)控和管理.中國(guó)和世界一些國(guó)家采用了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度,因此研發(fā)轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)技術(shù)具有重大實(shí)際意義.本研究以轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因產(chǎn)品中的表達(dá)產(chǎn)物-Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白作為研究對(duì)象,利用免疫分析技術(shù),建立了定量檢測(cè)Bt系列蛋白的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù),并研制其產(chǎn)品,為轉(zhuǎn)基

2、因產(chǎn)品的快速、大批量檢測(cè)和基因標(biāo)識(shí)制度提供了技術(shù)支撐. 本研究利用Bt(BtCrylAc、BtCry2Aa/2Ab)蛋白作為免疫原免疫小鼠制備了多克隆抗血清,并通過(guò)飽和硫酸銨鹽沉淀法進(jìn)行純化,其效價(jià)分別為52000和50000(間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法),與不同Bt蛋白交叉反應(yīng)率均小于0.3﹪,親和常數(shù)(K)均大于10<'9>,符合建立ELISA分析技術(shù)的質(zhì)量要求. 采用改良的過(guò)碘酸納簡(jiǎn)易法對(duì)Bt蛋白進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(

3、HRIP)標(biāo)記,經(jīng)紫外分光光度法鑒定,結(jié)果表明:兩種抗原(BtCrylAc、BtCry2Aa/2Ab)的標(biāo)記率分別為0.52和0.65,克分子比分別為1.29和0.9. 在進(jìn)一步進(jìn)行包被條件、抗體(抗血清)和酶標(biāo)抗原工作濃度優(yōu)化的基礎(chǔ)上,建立了Bt蛋白的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù),并進(jìn)一步研制了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒,結(jié)果如下:(1)BtCrylAc蛋白直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品:測(cè)定范圍為50ng/ml～1600ng/

4、ml,靈敏度為50ng/ml;添加回收率在95.56～102.27﹪之間,平均回收率為98.74﹪,與間接ELISA方法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著差異;試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)在2.25～7.20﹪之間,平均變異系數(shù)為4.78﹪,板間變異系數(shù)在2.62～10.21﹪之間,平均變異系數(shù)為6.71﹪;試劑盒在4℃下可保存6個(gè)月以上.(2)BtCry2Aa/2Ab蛋白直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品:測(cè)定范圍為40ng/ml～1750ng/ml,靈敏度為4