2015藥典無(wú)菌檢查常州培訓(xùn)

1、1,2015藥典-無(wú)菌檢查,江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,2024年3月,1,2,主要內(nèi)容,無(wú)菌產(chǎn)品理念無(wú)菌和無(wú)菌檢查法概念 無(wú)菌操作及無(wú)菌技術(shù)要求無(wú)菌檢查法的局限性醫(yī)療器具無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件及人員要求試驗(yàn)主要設(shè)備培養(yǎng)基種類用途及配制要求培養(yǎng)基適用性檢查方法適用性試驗(yàn)供試品的無(wú)菌檢查,2024年3月,2,1、無(wú)菌產(chǎn)品理念,滅菌產(chǎn)品的無(wú)菌保證不能依賴最終產(chǎn)品的無(wú)菌檢驗(yàn)，它是作為確定批無(wú)菌產(chǎn)品是否無(wú)菌的一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目，而產(chǎn)品

2、的無(wú)菌保證要取決于生產(chǎn)過(guò)程中采用合格的滅菌工藝、良好的無(wú)菌保證體系和嚴(yán)格的GMP管理。,2024年3月,3,3,4,無(wú)菌 ：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無(wú)菌檢查法 ：用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。,2 、無(wú)菌和無(wú)菌檢查法概念,2024年3月,4,3、無(wú)菌操作及無(wú)菌技術(shù)要求,無(wú)菌操作 是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對(duì)無(wú)菌制品或無(wú)菌器械等進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程中，能防止微

3、生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。無(wú)菌技術(shù) 是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其他干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，無(wú)菌試驗(yàn)器材及無(wú)菌操作。,2024年3月,5,5,4、無(wú)菌檢查法的局限性,若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試 品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。,2024年3月,6,6,7,5、 醫(yī)療器具無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù),本規(guī)范選用于《中國(guó)藥典》2015年版 四部 1101無(wú)菌檢查法。GB/T 142

4、33.2-2005 《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 ，第二部分：生物試驗(yàn)方法中規(guī)定的無(wú)菌試驗(yàn)方法。,2024年3月,7,8,6、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件要求,2015藥典無(wú)菌檢查：應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度

5、驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。,2024年3月,,8,6.1實(shí)驗(yàn)環(huán)境潔凈度要求（修改）,2024年3月,9,,9,10,6.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境人員要求：,菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并 經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)。,2024年3月,10,11,7 、試驗(yàn)主要設(shè)備,細(xì)菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)可調(diào)溫的培養(yǎng)箱顯微鏡臺(tái)式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器電熱恒溫干燥箱集菌儀,2024年

6、3月,11,12,試驗(yàn)儀器（1） - 超凈工作臺(tái),2024年3月,12,13,試驗(yàn)設(shè)備（2）--隔水式恒溫培養(yǎng)箱,2024年3月,13,14,試驗(yàn)設(shè)備（3）----霉菌培養(yǎng)箱,2024年3月,14,15,試驗(yàn)設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器,2024年3月,15,16,試驗(yàn)設(shè)備（5）--臺(tái)式蒸汽滅菌器,2024年3月,,16,17,試驗(yàn)設(shè)備（6）-- 顯 微 鏡,2024年3月,,17,18,試驗(yàn)設(shè)備（7）-生物安全柜,2024年3月

7、,,18,19,試驗(yàn)設(shè)備（8）Equinox 全自動(dòng)無(wú)菌檢驗(yàn)系統(tǒng),2024年3月,19,20,8、 培養(yǎng)基種類及用途,硫乙醇酸鹽流體基（主要用于厭氣菌培養(yǎng)、也可用于需氧菌培養(yǎng)）胰酪大豆胨液體基（用于真菌和需氧菌培養(yǎng)）,,2024年3月,,20,21,8.1 培養(yǎng)基配制及要求,培養(yǎng)基的滅菌 ：配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。保存時(shí)間：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：2 ～25℃、避光環(huán)境。 非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用； 密

8、閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用。,2024年3月,21,22,8.2 培養(yǎng)基配制及要求,硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：配制后調(diào)節(jié)PH值為弱堿性，使滅菌后在25 ℃的pH為7.1±0.2，分裝在適宜的容器中，其裝量與容器高度的比列應(yīng)符合培養(yǎng)后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1／5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一

9、次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：置30～35℃培養(yǎng)。,2024年3月,22,23,8.3 培養(yǎng)基配制及要求,胰酪大豆胨液體基：取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，濾過(guò)，調(diào)節(jié)PH值約為7.3±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體基：置20～25℃培養(yǎng)。,2024年3月,23,24,8.4 培養(yǎng)基配制及要求,培養(yǎng)基裝量：對(duì)于采用直接接種法檢查的供試品，應(yīng)根據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量

10、應(yīng)符合接種的供試品體積不大于培養(yǎng)基體積的10%。供試品檢查時(shí)，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗(yàn)。,2024年3月,24,25,9、培養(yǎng)基適用性檢查,無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查及靈敏度檢查的要求。無(wú)菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），置培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。靈敏度檢查：用于培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代）

11、，采用適宜的方法保存；并以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。,2024年3月,25,26,9.1 培養(yǎng)基適用性檢查,菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003銅綠色假單胞菌[CMCC(B)10104] 枯草桿菌[CMCC(B)63501] 生孢梭菌[CMCC(B)64941] 白色念珠菌[CMCC(F)98001] 黑曲霉[CMCC(F)98003],2024年3月,26,27,2024年3月,注：10倍梯

12、度稀釋；選擇適宜的3個(gè)稀釋級(jí)別；要求＜100cfu/ml。,27,28,9.2 培養(yǎng)基適用性檢查,菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18 ～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上， 20～25℃培養(yǎng)24 ～48h，上述培養(yǎng)物用pH7.0無(wú)菌氯化鈉

13、-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 20～25℃培養(yǎng)5 ～ 7天，加入3～ 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu孢子懸液；（如表9.3）注：菌懸液在室溫

14、下2h使用,若保存在2 ～8 ℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。,2024年3月,28,29,9.3 培養(yǎng)基靈敏度檢查,2024年3月,培養(yǎng)基靈敏度檢查使用6株菌見(jiàn)下表,29,30,9.4 培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種 　　　　　　　　　　　　 金黃色葡萄球菌2支 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 銅綠假單胞菌2支　 12ml（7支）

15、 生孢梭菌2支 空白對(duì)照1支 分別接種小于100cfu金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌菌懸液各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)3天，逐日觀察結(jié)果。,,2024年3月,30,31,9.5培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種　　　 枯草芽孢桿菌 2支

16、 胰酪大豆胨液體基 白色念株菌 2支 9ml（7支） 黑曲霉 2支　　 　 　　 空白對(duì)照1支 每分別接種小于100cfu枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑

17、曲霉各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。,,2024年3月,31,32,9.6 培養(yǎng)基適用性檢查,結(jié)果判斷 空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,2024年3月,32,33,10. 方法適用性試驗(yàn),試驗(yàn)?zāi)康?1)進(jìn)行無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查；2)若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新

18、進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)；3)方法適用性試驗(yàn)按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。,2024年3月,33,34,10.1 方法適用性試驗(yàn),菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌  、 生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。

19、注：大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。,2024年3月,34,10.2 方法適用性試驗(yàn),35,2024年3月,36,10.3 方法適用性試驗(yàn),結(jié)果判斷 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。可采用：1)

20、增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)使用中和劑，或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。注：方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。,36,2024年3月,11、供試品的無(wú)菌檢查,無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，若需試驗(yàn)表面活性劑、中和劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。,37,37,2024年3

21、月,11.1 供試品無(wú)菌檢查,38,2024年3月,11.2 供試品的無(wú)菌檢查,陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：,39,2024年3月,11.3 供試品的無(wú)菌檢查,陰性對(duì)照 ：供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照；陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。,2024年3月,40,40,41,11.4 供試品的無(wú)菌檢查,薄膜過(guò)濾法：薄膜過(guò)濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過(guò)濾器。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直

22、徑約為50 mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥，為發(fā)揮濾膜最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試品經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜。每張濾膜每次沖洗量為100ml.,且總沖洗量不得超過(guò)1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。,2024年3月,41,11.5 供試

23、品的無(wú)菌檢查,水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過(guò)濾，或混合至含不少 于100ml適宜稀釋的無(wú)菌容器中，混勻，立即過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜。沖洗次數(shù)不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗(yàn)。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。,例如：,42,2024年3月,11.6供試品的無(wú)菌檢查,水溶性固體供試品：取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解

24、或按標(biāo)簽說(shuō)明復(fù)溶，然后按水溶液供試品項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作。具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個(gè)小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無(wú)菌容器中，然后照水溶液供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無(wú)菌檢查。,43,2024年3月,11.7 供試品的無(wú)菌檢查,具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個(gè)小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無(wú)

25、菌容器中，然后照水溶液供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無(wú)菌檢查。,44,2024年3月,45,11.8 供試品無(wú)菌檢查,直接接種法： 適用于無(wú)法用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無(wú)菌檢查時(shí)兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等；生物制品無(wú)菌檢查時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2：

26、1。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時(shí)，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗(yàn)。,2024年3月,45,11.9 供試品的無(wú)菌檢查,例 如：,46,2024年3月,11.10 供試品的無(wú)菌檢查,培養(yǎng)及觀察：將接種的供試品后培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制

27、品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份，一份置30～35 ℃， 一份置20～25 ℃培養(yǎng)。 培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。若加入供試品后或培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判定是否有菌。,47,2024年3月,48,10.11 供試品的無(wú)菌檢查,結(jié)果判斷：陽(yáng)性對(duì)照管

28、應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)，否則試驗(yàn)無(wú)效。若供試品管均澄清，或顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)判供試品符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含?！　?符合下列任何一個(gè)條件，可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效： （1）無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求。 （2）回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污

29、染的因素。 （3）供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。,2024年3月,48,49,11.12 供試品的無(wú)菌檢查,結(jié)果判斷：試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。 重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定； 若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。,2024年3月,49,表1 批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗(yàn)數(shù)量,2024年3月,50,注