藥品的無菌檢查技術(shù)

1、教學(xué)目標(biāo),1、學(xué)會直接接種法無菌檢查的操作。2、懂得無菌檢查供試品溶液的制備。 3、熟知無菌檢查的結(jié)果判斷。4、學(xué)習(xí)薄膜無菌檢查法的使用。5、掌握影響無菌檢驗的因素和解決辦法。,教學(xué)重點：直接接種法無菌檢查的操作。,教學(xué)難點：薄膜無菌檢查法的使用。,第五節(jié) 直接接種檢查技術(shù),藥品無菌檢查法的具體操作方法可分為直接接種法和薄膜過濾法?！吨袊幍洹罚?005年版）指出：如供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。進(jìn)行供試品無菌檢

2、查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。直接接種法即每支（或瓶）供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10％，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。,由于直接接種法具有操作簡便等優(yōu)點，特別適宜無

3、抑菌和防腐作用藥品的無菌檢查。據(jù)統(tǒng)計，《中國藥典》（2005年版(二部)共有57種單列品種（占39.3％）采用該法規(guī)定。 操作時，用適當(dāng)?shù)南疽簩┰嚻啡萜鞅砻婊蛲獍b采用浸沒或擦試的方法徹底消毒。如果容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭），向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。 無論使用何種檢查法，其檢查操作過程均包括供試品的處理及接種與培養(yǎng)及觀察兩大步驟。,除另有規(guī)定外，供試

4、品處理按照樣品的不同用以下方法處理與接種。 1．混懸液等非澄清水溶液供試品 該類供試品操作最簡單，取規(guī)定量的供試品直接無菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 2．固體制劑供試品 取規(guī)定量的供試試品，無菌操作直接接種至各管培養(yǎng)基中；或供試品中加入適宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量無菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 3．β-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品 取規(guī)定量供試品，混合，加入適量的無菌β-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏?/p>

5、中和，接種至各管培養(yǎng)基中，或直接接入含β-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬母鞴芘囵B(yǎng)基中。 4．非水溶性供試品 取規(guī)定量供試品，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。,一、供試品的處理及接種,5．敷料供試品 取規(guī)定數(shù)量，每個包裝以無菌操作拆開，于不同部位剪取約100 mg或１cm×3cm的供試品；接種于各管足以浸沒供試品

6、的適量培養(yǎng)基中。 6．腸線、縫合線等供試品　　腸線、縫合線及其它一次性的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。 7．滅菌醫(yī)用器具供試品 　取規(guī)定量，必要時應(yīng)將其拆散或切成小碎塊，接種于各管足以侵沒供試品的適量培養(yǎng)基中。 8．放射性藥品 取供試品1瓶（支），接種于裝量為7．5ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中。每管接種量為0．2ml。,接種陰性對照,與此同時另

7、取1支硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基管，加入上述同一容器內(nèi)的供試品稀釋液或0.9％滅菌氯化鈉溶液1 ml，作陰性對照。（作陰性對照的目的是說明未接檢品前的培養(yǎng)基和供試品稀釋液及無菌檢查操作都是無菌生長的，而供試品陽性檢出的菌確是來自檢品。）[如供試品液未經(jīng)驗證試驗，可同步進(jìn)行，方法見第五節(jié)的直接接種法的驗證試驗]。,接種陽性對照,根據(jù)GMP和《中國藥典》要求，接種陽性對照應(yīng)在陽性對照室中進(jìn)行，以防交叉污染。接種時應(yīng)按驗證試驗的結(jié)果選擇陽性對照菌。方法

8、是：在相應(yīng)的培養(yǎng)基中接入小于100個cfu的陽性對照菌（菌液的制備和同培養(yǎng)基靈敏度檢查菌液的制備相同）。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量（見表6－2、表6－3）相同。陽性對照管培養(yǎng)48~72 h應(yīng)生長良好。,二、培養(yǎng)及觀察,培養(yǎng)基,,按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 d,逐日觀察并記錄,渾濁,,新鮮培養(yǎng)基或劃線斜面培養(yǎng)基,,培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢,,,判斷是否有菌,三、結(jié)果判斷,供試品符合規(guī)定,培養(yǎng)基管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證

9、無菌生長,,供試品不符合規(guī)定,,培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長,除非能充分證明生長的微生物非供試品所含。當(dāng)滿足下列至少一個條件時，判試驗結(jié)果無效：⑴ 對無菌檢查試驗相關(guān)設(shè)施的微生物監(jiān)控數(shù)據(jù)表明其不符合規(guī)定。⑵ 對無菌試驗過程的回顧，揭示了本操作程序是錯誤的。⑶ 陰性對照管有菌生長。⑷ 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。,試驗若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取

10、同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。,直接接種法圖示,無抗菌作用的供試品,,抽樣,,接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,,培養(yǎng),,每天觀察觀察14天,報告,,,,澄清無混濁,合格,混濁（疑似情況）,鏡檢重新培養(yǎng),,確證,無菌有菌,,,不合格,培養(yǎng)基,直接接種法教學(xué)片,第六節(jié) 薄膜過濾法檢查技術(shù),該法是各國藥典和《中國藥典》規(guī)定的第二種無菌檢查的方法，適用于任

11、何類型藥品的無菌檢查。具有適用性廣，準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點?！吨袊幍洹罚?005年版）規(guī)定：如供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。據(jù)統(tǒng)計，《中國藥典》（2005年版二部）共有88種單列規(guī)定品種（占60.7％）規(guī)定采用該法。薄膜過濾法可采用封閉式薄膜過濾器（圖6－2）或一般薄膜過濾器（圖6－3），但應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過濾器。,,,圖6-4：HTY微孔濾膜孔徑測定儀,圖：濾膜阻擋的細(xì)菌,一般新購得一批濾膜，因各廠家生產(chǎn)相同規(guī)格的濾膜其質(zhì)量不盡

12、一致，應(yīng)對濾膜任選以下三種方法中的一種進(jìn)行孔徑大小的測試，符合規(guī)定的濾膜才能用于無菌檢查。 （一） 氣泡法 　其原理是測濾膜孔徑的大小，可用氣泡壓力方法（圖6-4）測定。先將濾膜浸入水中，使完全濕潤，然后用鑷子夾住一片濾膜放于氣泡點測定裝置上(硬聚氯乙烯氣泡點測定裝置，上海化工廠生產(chǎn)DY＝25)或濾膜孔徑測定儀上，膜上放一塊與濾膜大小相同的尼龍篩網(wǎng)，再加上多孔板，將螺旋固定圈旋緊，在多孔板上加3～5 mm深的水(注意排除氣泡)關(guān)閉

13、放氣閥，啟動空壓機(jī)或氮氣閥，使壓力緩緩上升，注意觀查水面上產(chǎn)生第一個氣泡時，記錄壓力表的壓力，氣泡點壓力不應(yīng)小于0.2 MPa(2.2 kg/cm2)。,（二）水流量法,,其原理是在一定的壓力下，定量的水在單位時間內(nèi)通過濾膜的流量與孔徑及孔隙率有關(guān)。將濾膜裝于除菌濾器上，開動真空泵，壓力在93 KPa(700 mm Hg)下，抽濾已濾清的水約500 ml，計算出每1 mim的濾速。《中國藥典》對濾膜的濾速未明確規(guī)定，而SP(ⅩⅩⅢ)規(guī)

14、定在93 KPa(700 mm Hg)壓力下，濾膜直徑47 mm；流速55～75 mm/min。此法操作簡單，但誤差大。,（三） 細(xì)菌過濾法,其原理是利用細(xì)菌細(xì)胞大小穩(wěn)定的特性，可將標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的菌液，用待測濾膜過濾，其濾液經(jīng)培養(yǎng)無菌生長，則該濾膜孔徑符合規(guī)定。常用的細(xì)菌為粘質(zhì)沙雷菌(CMCC(B)41002)，將該菌的斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35Ｃ培養(yǎng)18～20 h，用0.9％氯化鈉溶液稀釋至10-3(約相當(dāng)于7x1

15、05cfu/ml)取此菌液1 ml加至50 ml 0.9％氯化鈉溶液中，按薄膜過濾法過濾，取該濾液5 ml接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基40 ml中，30～35℃培養(yǎng)24 h，應(yīng)無菌生長，而將濾膜加至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基管中應(yīng)有菌生長，證明該濾膜濾效合格。,三、薄膜過濾法檢查的操作,應(yīng)根據(jù)不同供試品而用不同的樣品處理法來進(jìn)行。 應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑不大于0.45μm，直徑為47mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾

16、膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，且總過濾量不宜太大，以避免濾膜上的微生物受損傷。下面就不同供試品的處理操作介紹如下：,1．水溶液供試品,取規(guī)定量，直接

17、過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。 沖洗后，如用封閉式過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如果僅用薄膜過濾器，則無菌操作取出濾膜，將其剪成3等份；分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中1份接種陽性對照值做陽性對照用。,2．可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，

18、加適宜的溶劑溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。,3．β-內(nèi)酰胺類供試品　　取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理方法處理，立即過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量β-內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時培養(yǎng)基中可加入少量的β-內(nèi)酰胺酶；或?qū)V膜直接接入含適量β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法照水溶液供試品項下的方法操作。,4．非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過濾；或混合

19、溶于含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，過濾。用含0．1%～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少三次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項下的方法操作。,5．可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯（無菌十四烷酸異丙酯的制備：采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜，并經(jīng)140℃干熱滅菌2 h）中， 劇烈振搖，使供試品充分溶解

20、，如果需要可適當(dāng)加熱，但溫度不得超過44℃），趁熱迅速過濾。若無法過濾，應(yīng)加入不少于100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及培養(yǎng)基接種照非水溶液供試品項下的方法操作。,6．無菌氣（噴）霧劑供試品 取規(guī)定量，將各容器置冰室冷凍約1 h。以無菌操作迅速在溶器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，然后照水溶性制劑或非水溶性制劑項下的方法操作。,7．裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量，裝上無菌針頭

21、（非包裝中所配帶的），若需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解，然后照水溶性制劑或非水溶性供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。,8．具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品　　取規(guī)定量，每個最小包狀用50~100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。,四、培養(yǎng)及觀察　　同直接接種檢查法。五、結(jié)果判

22、斷　　同直接接種檢查法。,開放式薄膜過濾法操作,,將藥品加入無菌稀釋劑溶液中,,無菌稀釋劑溶劑分3次洗滌濾膜,,取下濾膜,除去掉上層濾紙,,將濾膜分成3份,,加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,,按規(guī)定溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng),薄膜過濾法檢查 教學(xué)片,第七節(jié) 無菌檢查各種中和(滅活)劑的作用機(jī)理,一、硫乙醇酸鹽、半胱氨酸、巰基化合物的作用機(jī)理　　 此類化合物因含有SH基，可以和重金屬結(jié)合,因而能解除或阻止含汞、

23、含砷鹽等重金屬化合物對細(xì)菌的毒害或抑制作用。此外硫乙醇酸鹽可維持培養(yǎng)基中氧化還原電位，特別是保持培養(yǎng)基下層的厭氧條件，有利于厭氧菌生長。而半胱氨酸可作為細(xì)菌長所需的氮源。,二、青霉素酶的作用機(jī)理　　 青霉素酶是目前較理想的青霉素滅活劑，它能通過破壞青霉素結(jié)構(gòu)中的β—內(nèi)酰胺環(huán)迅速完全而特異地使青霉素滅活。,三、 對氨基苯甲酸的作用機(jī)理　　 磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸非常相似，因此它可以竟?fàn)幮缘厝〈~酸結(jié)構(gòu)中的對氨基苯