基于ngs的微生物多組學(xué)在人體微生態(tài)領(lǐng)域

1、鄧旭旭 高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理xuxudeng@genome.cn 安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司,人體微生態(tài)overview,Byrd A. L.,et.al. Nature. 2014.,Sender R., et al. Cell. 2016.,人體微生態(tài)overview,B:H≈1.3:1,如何定義健康菌群？,Lloyd-Price J., et al. Genome Medicine. 2016.,從組成、功能動(dòng)態(tài)變化、生態(tài)學(xué)

2、功能等方面來定義健康微生物組,不同健康人群中的共有物種,不同健康人群中的 共有核心酶類、代謝通路等,利用簡(jiǎn)化的自由能級(jí)圖模型來描述健康微生物組的動(dòng)態(tài)變化,健康微生物組也可以用生態(tài)學(xué)形成模式來定義,被遺忘的精準(zhǔn)醫(yī)療重要領(lǐng)域,,,Sun X., et al. Nature Reviews Drug Discovery. 2016.,被遺忘的精準(zhǔn)醫(yī)療-人體微生態(tài),微生態(tài)制劑發(fā)明專利,基于微生態(tài)的醫(yī)療公司現(xiàn)狀,,腸道菌群文章發(fā)表趨勢(shì),Pubme

3、d: Search (microbiota[Title/Abstract]) AND gut[Title/Abstract]),Publications on gut microbiota,微生物研究動(dòng)態(tài),Science特刊關(guān)注腸道微生物組,2016年，三篇report，3篇review，一篇perspective文章，涉及生活習(xí)慣對(duì)腸道菌群的影響、糞便移植、腸道菌群與免疫，腸道菌群與抗生素等領(lǐng)域。,微生物研究國(guó)際計(jì)劃,微生物研究國(guó)際

4、計(jì)劃,中國(guó)微生物組計(jì)劃（CMI）,研究方向: “6+2”模式6個(gè)領(lǐng)域: 人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動(dòng)物腸道、工業(yè)以及海洋;兩個(gè)方向: 微生物組研究方法及應(yīng)用技術(shù)平臺(tái)和微生物組數(shù)據(jù)儲(chǔ)存及功能挖掘。,微生物樣本,分離純培養(yǎng),僅能檢測(cè)＜1%的微生物物種,分子生物學(xué)技術(shù),微生物群落結(jié)構(gòu)的全面解析,傳統(tǒng)方法,2007年前，分子生物學(xué)方法,高通量測(cè)序,PCR-DGGE,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,克隆文庫,微生物培養(yǎng),工作量大：克隆—構(gòu)建載體—轉(zhuǎn)化—單克

5、隆選擇—一代測(cè)序,微生物態(tài)的研究技術(shù)基礎(chǔ),,,宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,宏基因組測(cè)序,mRNA差異表達(dá)和代謝通路,功能基因分析和代謝通路,物種組成、群落結(jié)構(gòu)……,16S/18S/ITSSequencing,測(cè)序技術(shù),研究目的,基于高通量測(cè)序的微生態(tài)研究方法,單菌株de novo測(cè)序,單菌株的基因組信息、致病性,16S rDNA測(cè)序是最常用的細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)指定環(huán)境中微生物16S rDNA高變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測(cè)序，分析該環(huán)境下微生物群落

6、的多樣性，包括物種的分類信息和豐度信息等。研究對(duì)象：特定環(huán)境中細(xì)菌或古細(xì)菌。,16S rDNA基因測(cè)序,16S rDNA 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),18S rDNA 的結(jié)構(gòu),18S rDNA/ITS基因測(cè)序,18S rDNA/ ITS測(cè)序是常用的真菌分類標(biāo)準(zhǔn)，指定環(huán)境中真菌的高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，反映不同樣本的物種間差異，分析該環(huán)境下微生物群落的多樣性，包括物種的分類信息和豐度信息等。研究對(duì)象：特定環(huán)境中真菌群落。,ITS的結(jié)構(gòu),一般

7、用于海洋微生物樣本,宏基因組測(cè)序（Metagenomic）,基于NGS的微生物研究技術(shù)比較,16S/18S/ITS rRNA基因測(cè)序宏基因組測(cè)序,Wang, et al. Nature Reviews Genetics. 2014.,多樣性分析/宏基因組技術(shù)的區(qū)別,物種組成、群落結(jié)構(gòu)、Alpha & Beta 多樣性分析等,功能基因、代謝通路等,,獨(dú)有技術(shù),精準(zhǔn)宏基因組技術(shù),研究目的： 除了常規(guī)的宏基因組分析外，還可以發(fā)掘低

8、豐度物種；顯著改善微生物基因組組裝效果，甚至能組裝出draft genome 。,梯度稀釋,單細(xì)胞文庫及測(cè)序,低豐度物種、draft genome,精準(zhǔn)宏基因組“三要素”,如何理解精準(zhǔn)宏基因組測(cè)序？,Opportunities enabled by single-cell sequencing strategies,Gawad C., et.al. Nature Reviews Genetics. 2016.,宏基因組測(cè)序,精準(zhǔn)宏基因

9、組測(cè)序,單細(xì)胞微生物測(cè)序,精準(zhǔn)宏基因組,單細(xì)胞微生物技術(shù),獨(dú)有技術(shù),研究思路—overview,癥狀表型,健康記錄,臨床醫(yī)學(xué)研究,臨床信息采集：BMI血糖血壓蛋白代謝因子…….,生物機(jī)制研究,物種組成、功能基因、代謝通路...,臨床診斷與治療效果,靶標(biāo)鑒定與分子機(jī)制,研究思路—tools,Weinstock G. M., Nature. 2012.,,,,,,,,,研究流程,取樣策略（key point）,多個(gè)體，多位點(diǎn)，大

10、樣本量，以排除個(gè)體之間的差異,遺傳背景、生活飲食習(xí)慣、生長(zhǎng)環(huán)境、性別年齡、取樣方法、提取方法一致,排除有嚴(yán)重病史、使用抗生素、有藥物依賴等個(gè)體,采集與研究疾病相關(guān)的生理生化指標(biāo)，研究致病性原因,欲解決的問題,,,,腸道菌群經(jīng)典案例解析,人體微生物質(zhì)量分布圖,人體正常菌群種類1000余種；主要分布于腸道、皮膚、口腔、呼吸道、泌尿生殖道，大多定植腸道；腸道微生物主要有細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌及病毒，其中99%以上為細(xì)菌；各部位由不同特異性腸

11、道菌群構(gòu)成；人體微生物組和人體基因組組成超個(gè)體 (Super organism)，共同參與人體正常功能。,腸道是人體微生態(tài)菌群分布重要場(chǎng)所,結(jié)腸癌、大腸癌IBD（克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎）代謝綜合征：糖尿病，肥胖動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病，心腦血管疾病等過敏性疾病精神性疾?。汗陋?dú)癥，焦慮抑郁，慢性疲勞綜合征等艾滋病風(fēng)濕性疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）,王子愷，楊云生. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012彭麗華，楊云生. 中華消化雜志， 2

12、013,腸道微生物與人類疾病,影響腸道微生態(tài)的因素,內(nèi)在因素胃酸氧氣動(dòng)力粘液胃腸分泌抗菌肽免疫（sIgA）,外在因素飲食益生菌PPI，H2抗生素動(dòng)力藥瀉藥NSAIDs阿片肽,影響腸道微生態(tài)的構(gòu)成或功能,Simre´n Magnus, et al.Gut .2013.,影響腸道微生態(tài)的因素,來自MicroClub-LCH.,腸道菌群與致病性之間的關(guān)系,Round et.al .nature revi

13、ews immunology.2009,免疫系統(tǒng)失衡，致病菌趁虛而入，造成人體疾病,Moya &Ferrer, et al. trends in microbiology.2016.,由因到果,由果到因,腸道生態(tài)系統(tǒng)的功能性冗余模型：腸道菌群與宿主基因、蛋白、代謝組、腸道屏蔽（腸道粘膜、上皮細(xì)胞）的關(guān)聯(lián)性,腸道微生態(tài)的研究的材料,www.dnagenotek.com,1、腸道菌群與癌癥—perspective,腫瘤微生物組,

14、Thomas R M., et al. Trends in cancer. 2015.,Trends in cancer：癌癥與微生物組綜述,1、腸道菌群與癌癥：overview,腸道粘膜處組織由健康到惡性腫瘤的過程以及微生物在其中的致病過程,Garrett W. S., et al. Science. 2015.,Science：癌癥與微生物組綜述,研究樣本：70個(gè)病人（59個(gè)結(jié)直腸癌、21個(gè)腸息肉患者）、59個(gè)正常個(gè)體；43個(gè)糞便

15、和59個(gè)粘膜樣本文庫構(gòu)建：16S文庫，V3/V4區(qū)測(cè)序平臺(tái)及策略：Illumina MiSeq 平臺(tái), PE250,1、腸道菌群與癌癥,Flemer B., et al. Gut. 2016.,結(jié)直腸癌中與癌癥相關(guān)&不相關(guān)的微生物,結(jié)腸直腸癌患者粘膜的微生物群與健康人不同,微生物組成及基因表達(dá)的改變不僅限于腫瘤組織，并且這些改變?cè)谂c腫瘤組織距離不同的部位也不盡相同,研究結(jié)果展示,健康與病人OTUs的co-abunda

16、nce network analysis,結(jié)腸直腸癌患者粘膜的微生物群與健康人不同。 微生物組成及基因表達(dá)的改變不僅限于腫瘤組織，并且這些改變?cè)谂c腫瘤組織距離不同的部位也不盡相同。,研究結(jié)果展示,2、腸道菌群與炎癥性腸病,研究樣本：235個(gè)病人、38個(gè)健康個(gè)體的糞便樣本；文庫構(gòu)建：16S文庫：V3-V4區(qū)；ITS文庫：ITS1區(qū)測(cè)序平臺(tái)及策略：16S&ITS： Illumina MiSeq，PE250,與疾病有關(guān)的

17、物種,Sokol H., et al. Gut. 2016.,炎癥性腸病中真菌微生物的失調(diào),細(xì)菌群落的變化,真菌群落的變化,研究結(jié)果展示,與IBD有關(guān)的細(xì)菌和真菌物種,研究結(jié)果展示,3、腸道菌群與血栓,研究樣本：3年內(nèi)，4007個(gè)人樣本；無菌小鼠若干研究技術(shù)：LC-MS/MS、16S r RNA測(cè)序測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq ，PE250,Zhu W., et al. Cell. 2016.,腸道菌群代謝氧化三甲胺

18、，增加血小板高反應(yīng)性和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn),TMAO與血栓形成有密切的關(guān)系,腸道菌群在血栓形成過程中起到關(guān)鍵作用,研究結(jié)果展示,無菌小鼠接受不同食物而導(dǎo)致腸道菌群的變化,研究結(jié)果展示,血漿中TMAO水平的升高預(yù)示血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加；TMAO能極大的激活依賴性血小板；在體內(nèi)，飲食中的膽堿、腸道微生物和TMAO與血栓相關(guān)；盲腸移植實(shí)驗(yàn)表明血栓的風(fēng)險(xiǎn)也可移植。,菌群移植后小鼠腸道的物種與TMAO有關(guān)，移植實(shí)驗(yàn)表明血栓的風(fēng)險(xiǎn)也可移植,研究結(jié)果

19、展示,4、腸道菌群與肥胖：overview,4、腸道菌群與肥胖,研究樣本：RYGB、VGB、肥胖女子各7個(gè)；10周大的無菌小鼠若干文庫構(gòu)建：300bp小片段文庫測(cè)序平臺(tái)及策略：Illumina HiSeq 2000平臺(tái), PE100數(shù)據(jù)產(chǎn)出：63Gb，平均每個(gè)樣本3Gb,Tremaroli V.,et.al. Cell metabolism. 2015.,減肥手術(shù)有助于腸道菌群減少脂肪積累,4、腸道菌群與肥胖,RYGB與

20、肥胖患者物種有顯著差異,RYGB、VBG、肥胖患者GO顯著性差異分析,RYGB、VBG手術(shù)對(duì)腸道菌群的改變是長(zhǎng)期的。RYGB、VBG改變了bile acid （和）TMAO 的代謝。手術(shù)能夠改變有助于脂肪增重的腸道菌群。,RYGB、VBG、肥胖患者的腸道菌群移植到小鼠中體重隨時(shí)間的變化,研究結(jié)果展示,5、腸道菌群與抗生素抗性,研究樣本：84個(gè)早產(chǎn)兒的401個(gè)糞便樣本；文庫構(gòu)建：小片段文庫：500-600bp；16S文庫：V4區(qū)

21、測(cè)序平臺(tái)及策略：宏基因組：Illumina HiSeq 2500, PE15016S rRNA： Illumina MiSeq ，PE250數(shù)據(jù)產(chǎn)出：宏基因組：10個(gè)lane，每條lane約100Gb。,Gibson M. K., et al. Nature Microbiology. 2016.,早產(chǎn)兒腸道菌群在使用抗生素后的動(dòng)態(tài)發(fā)展,使用抗生素后早產(chǎn)兒腸道菌群的豐度明顯降低,變形門內(nèi)與抗生素選擇性有關(guān)的抗性基因,研究結(jié)果展

22、示,慶大霉素和萬古霉素治療后物種和抗性基因出現(xiàn)了特異性的富集,美羅培南、頭孢噻肟、替卡西林的使用與物種的減少密切相關(guān)?？苟喾N藥物的物種Escherichia、Klebsiella和Enterobacter 均與院內(nèi)感染有關(guān)。接受特異性治療后AR基因會(huì)發(fā)生富集，該過程是與單個(gè)物種的豐度密切相關(guān)。,研究結(jié)果展示,人體其它微生態(tài)案例解析,皮膚菌群里的有益菌和抗菌肽對(duì)抗皮炎,取樣方式：AD患者和年齡相當(dāng)?shù)姆茿D健康人群腋窩和上臂的皮膚損傷

23、的表層皮膚菌群。 測(cè)序技術(shù)：16S rRNA 測(cè)序篩選抗金黃色葡萄球菌的CoNS株系 ；基因組測(cè)序進(jìn)行CoNS株系 的鑒定。,Teruaki Nakatsuji,et al. SCI TRANSL MED.2017.,皮膚微生物,皮膚菌群里的有益菌和抗菌肽對(duì)抗皮炎,16s測(cè)序+基因組測(cè)序鑒定CoNS菌株,CoNS在正常人和AD患者的數(shù)量比較,CoNS菌株的低頻率與S.aureus的定殖相關(guān),CoNS產(chǎn)生的抗菌肽可選擇性殺死S.a

24、ureus，并與人體的抗菌肽起協(xié)同作用,在AD患者皮膚定植CoNS，可降低S.aureus的定植,,,,,分析技術(shù)路線,AD皮膚微生物菌群失調(diào)與金黃色葡萄球菌的移植相關(guān),皮膚菌群里的有益菌和抗菌肽對(duì)抗皮炎,皮膚菌群里的有益菌和抗菌肽對(duì)抗皮炎,金黃色葡萄球菌定植與CoNS缺乏抗菌活性相關(guān),生殖道微生物,取樣方式：取材：146個(gè)研究對(duì)象，其中94個(gè)研究對(duì)象具有完整的陰道拭樣、灌洗樣和細(xì)胞表型數(shù)據(jù)；另有若干臨床分析數(shù)據(jù)。 測(cè)序策略：

25、 從中選取12個(gè)樣品進(jìn)行NGS測(cè)序；16S rDNA測(cè)序： V4區(qū)，Illumina MiSeq，PE300bp；宏基因組測(cè)序：12個(gè)樣品，Illumina MiSeq，PE250。,女性生殖道炎癥的微生物群落變化,Anahtar M. N.,et.al. Immunity. 2015.,陰道微生物菌群分析,無婦科癥狀的婦女陰道微生物與多種外陰炎相關(guān)，該情況與性無關(guān),研究結(jié)果展示,細(xì)菌多樣性與促炎因子呈正相關(guān),對(duì)引起

26、促炎因子分泌的微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：Fusobacterium、Aerococcus、Sneathia、Gemella、Mobiluncus和Prevotella與促炎因子的分泌具有顯著相關(guān)性。,時(shí)間梯度上陰道菌群與促炎因子之間的關(guān)系,研究結(jié)果展示,血液微生物,宏基因組研究白血病患者血液中微生物的組成,Gyarmati P., Scientific Reports. 2016.,取樣方式：9個(gè)白血病患者，在不同發(fā)病期間，抽取靜脈血。測(cè)

27、序策略：宏基因組測(cè)序：Illumina HiSeq 2500，PE100，平均每個(gè)樣本3.35G數(shù)據(jù)量。,各物種的Reads比例及不同發(fā)病期間的物種Veen圖,白血病微生物物種群落結(jié)構(gòu),高通量測(cè)序表明：血液病中有：5個(gè)門，30個(gè)屬。,研究結(jié)果展示,取樣方式：取材：以182個(gè)婦女研究對(duì)象，其中93個(gè)研究對(duì)象是感染陽性；測(cè)序策略：16S測(cè)序：16S rRNA基因V4區(qū)；Illumina MiSeq， PE250,尿液微生物,急性尿

28、失禁造成女性尿道微生物的改變,Pearce M. M., American journal of obstetrics and gynecology. 2015.,不同取樣位點(diǎn)處的微生物組成不同,尿道感染陽性和陰性個(gè)體中豐度最高的15個(gè)物種,陽性和陰性個(gè)體尿道中的微生物組成有明顯的差異,研究結(jié)果展示,肺組織微生物,取樣方式：選取233個(gè)良性肺部組織和56個(gè)癌癥組織，質(zhì)檢排除部分樣本后，最終有有165個(gè)良性肺部組織和31個(gè)癌癥組織。同時(shí)

29、采集調(diào)查問卷、臨床數(shù)據(jù)、居住地PM10等數(shù)據(jù)。測(cè)序策略：16S rDNA基因測(cè)序：V3+V4區(qū)；Illumina MiSeq PE300,Yu G., et al. Genome Biology. 2016.,肺部微生物表征及其與流行病、臨床特征的關(guān)系,研究結(jié)果展示,肺部良性組織微生物的物種組成、功能特征,門層級(jí)上良性肺部組織核心微生物包括Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Act

30、inobacteria。利用PICRUSt基于16S基因預(yù)測(cè)的功能基因分析見fig1.b，功能基因的變化差異比物種差異變化要小。,研究結(jié)果展示,肺部組織微生物的組成與豐度與HMP上其它人體位點(diǎn)的微生物比較,良性肺部組織與研究對(duì)象居住地的關(guān)聯(lián)分析,不同居住地區(qū)病人的肺部微生物多樣性和Proteobacteria相對(duì)豐度有顯著的差異。,肺部組織微生物形成了截然分明的聚類簇，與口腔微生物等健康人體的微生物距離較遠(yuǎn)。,,,B,,C,,D,,A

31、,只有在菌株水平說明致病性機(jī)制才能從復(fù)雜的因素中得到確切的對(duì)應(yīng)關(guān)系。包含兩層含義：①用單個(gè)菌株來研究與疾病的關(guān)系，②致病性分析達(dá)到菌株水平。,菌株水平（ strain-specific ）,類似于GWAS分析，用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以對(duì)腸道菌群種類組成、功能基因組成和宿主代謝表型的變化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，目的是鑒定與及疾病、表型相關(guān)的微生物物種、基因或代謝物質(zhì)等。 該方法可以預(yù)測(cè)微生物組和疾病狀態(tài)的關(guān)系。,全微生物組關(guān)聯(lián)分析（MWAS）,可從物種

32、、基因等水平探討發(fā)病機(jī)制，可提供早期預(yù)警，在一定程度上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。,生物標(biāo)記物（biomarkers）,微生物多樣性、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組三者結(jié)合可以在群落水平、DNA和mRNA水平上同時(shí)進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)多重角度互相驗(yàn)證，全面解析微生物環(huán)境群落。,多組學(xué)研究（multi-omics）,人體微生態(tài)研究思路,生物標(biāo)記物挖掘,發(fā)掘潛在的基因或物種,,兒童腸道菌群在形成Ι型糖尿病的作用,取樣方式：33個(gè)從出生到3周歲的潛在患病

33、兒童糞便樣本。 樣品處理及數(shù)據(jù)量：宏基因組：Illumina HiSeq 2000 platform, PE100， 7 Gb raw data /sample 16S多樣性分析：16S V4區(qū)，989個(gè)樣本，Illumina MiSeq，添加5% PhiX，PE175(有97bp overlap)，65,076reads/sample。,Kostic A. D., et al. Cell host & microbe.

34、 2015.,非權(quán)重UniFrac距離的PCoA分析（16S）,KEGG代謝通路模塊隨時(shí)間的變化,腸道微生物群落和代謝通路的變化,嬰兒腸道微生物群落在成長(zhǎng)過程中物種變化劇烈，但代謝通路卻保持相對(duì)穩(wěn)定。,嬰兒腸道微生物物種隨時(shí)間變化（關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析）,腸道菌群特征 “識(shí)別”Ⅰ型糖尿病癥狀,Ⅰ型糖尿病發(fā)病前致病性腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,隱球菌,瘤胃球菌,小類桿菌,鏈球菌,測(cè)序策略：宏基因組測(cè)序： Illumina HiSeq 2000數(shù)據(jù)產(chǎn)

35、出：751,000,000 high-quality reads其他技術(shù)：qPCR,尋找結(jié)直腸癌非侵入式生物標(biāo)記物,Yu J.,et al. Gut. 2015.,圖1.結(jié)直腸癌患者失調(diào)的腸道微生物物種,圖2.與結(jié)直腸癌相關(guān)的微生物基因標(biāo)記物（A.C1群體主成分分析B.結(jié)直腸癌指數(shù)）,研究結(jié)果展示,20個(gè)與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的基因能區(qū)分大腸癌和健康對(duì)照組（圖2A）。與II型糖尿病（T2D）和炎癥性腸炎（IBD）相比，這20個(gè)基因在CR

36、C中特異性富集。驗(yàn)證集顯示其中4個(gè)基因標(biāo)記物在丹麥人群中發(fā)揮作用。在法國(guó)人群和奧地利人群中，這4個(gè)基因標(biāo)記分別在AUC =0.72及0.77下能區(qū)分結(jié)直腸癌患者和健康人。,凸腹真桿菌在對(duì)照組中富集，微單胞桿菌屬（專性厭氧菌，引起口腔感染）、具核梭桿菌（首次發(fā)現(xiàn)）和Solobacterium moorei（口臭致病菌）在CRC患者腸道中富集，兩種方法表明消化鏈球菌屬在患者組富集（圖1A）。發(fā)現(xiàn)一些口腔致病菌與大腸癌顯著正相關(guān)，如微單胞桿菌

37、屬、具核梭桿菌和Solobacterium moorei。,圖3.驗(yàn)證與結(jié)直腸癌相關(guān)的較好微生物基因標(biāo)記物,研究結(jié)果展示,（A.2個(gè)基因標(biāo)記物的qRCR豐度；B. AUC面積為0.84；CD.2個(gè)基因標(biāo)記物在健康人和結(jié)直腸癌不同階段的相對(duì)豐度）,在中國(guó)人群體中對(duì)其中2個(gè)基因標(biāo)記物進(jìn)行qPCR檢測(cè)，能準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)直腸癌患者和健康人（AUC=0.84, OR=23)，這些基因標(biāo)記物在結(jié)直腸癌的早期階段（I-II）富集，可以作為結(jié)直腸癌早期診

38、斷的生物標(biāo)記物。,取樣方式：50個(gè)患不同齲齒發(fā)生階段的4歲兒童，后續(xù)用20個(gè)患有嚴(yán)重齲齒和20個(gè)正常兒童驗(yàn)證，取牙菌斑和唾液樣本。 測(cè)序策略：16S多樣性分析：16S V1-V4區(qū)，測(cè)序平臺(tái)Roche 454 FLX。,Teng F., et al. Cell host & microbe. 2015.,口腔微生物預(yù)測(cè)幼兒齲齒的發(fā)生,通過信息分析發(fā)現(xiàn)20個(gè)物種能夠預(yù)測(cè)或判斷齲齒的發(fā)生,通過預(yù)測(cè)模型對(duì)2種常見物種進(jìn)行驗(yàn)證

39、,普氏菌屬的相對(duì)豐度最高，與對(duì)照組有顯著性差異，而另外一種被認(rèn)為是致病菌變異鏈球菌的豐度較低，無顯著性差異。,研究結(jié)果展示,菌株水平研究,深入研究導(dǎo)致致病性的物種,,菌株水平研究人體疾病的技術(shù)方案,菌株水平研究致病性的技術(shù)方案,Zhang C., et.al. Genome medicine.2016.,取樣方式：49個(gè)參試者，其中超重：肥胖=11:38，男性：女性=8:41；處理：6周CR（calorie restriction）飲

40、食+6周WS（weight stabilisation）飲食；檢測(cè)：本底水平和處理后糞便中Akk菌豐度、糞便微生物基因豐度、飲食和生物參數(shù)（BMI、血脂、NEFA、TGs、TC、LDL、HDL、IL-6、脂多糖及一些酶等）。,Dao M. C., et al. Gut. 2015.,肥胖癥患者飲食干預(yù)過程中Akkermansia muciniphila菌及代謝變化,研究結(jié)果展示,A. muciniphila菌與胰島素敏感性之間的相關(guān)性

41、,飲食干預(yù)對(duì)A. muciniphila菌豐度的影響,研究結(jié)果展示,A. muciniphila菌與MGS豐度的熱圖分析,A. muciniphila菌與MGS豐度總共有27個(gè)MGS（>500基因）與A. muciniphila菌變化顯著相關(guān)。,研究結(jié)果展示,臨床特征隨A. muciniphila菌和基因豐度變化（HGC：High Gene Count）,A. muciniphila菌和基因豐度較大的個(gè)體代謝狀態(tài)更健康。,Wang

42、 J.,et.al. Nature Reviews Microbiology. 2016.,MWAS技術(shù)方案設(shè)計(jì),研究群體選擇,樣本取樣,宏基因組測(cè)序,功能基因注釋,共豐度Genome binning,鑒定與疾病相關(guān)的因子,驗(yàn)證：統(tǒng)計(jì)+實(shí)驗(yàn),樣本情況：77個(gè)未治療病人和80個(gè)健康人： 212例糞便樣本；54個(gè)病人和51個(gè)健康人： 105個(gè)牙菌斑樣本；來自51個(gè)病人和47個(gè)健康人： 98個(gè)唾液樣本。其中有21個(gè)病人經(jīng)過DMARD

43、藥物治療。 測(cè)序策略：宏基因組分析：插入片段大小350bp，Illumina HiSeq 2000，PE100bp；糞便樣本產(chǎn)生：3,800,011 non-redundan genes；口腔樣本產(chǎn)生： 3,234,997 non-redundan genes。,MWAS研究中國(guó)人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,Zhang X.,et al. Nature Medicine. 2015.,研究結(jié)果展示,KEGG功能分析病人三個(gè)部位（腸道，牙

44、齒及唾液）菌群失衡情況,研究發(fā)現(xiàn)某些菌群在腸道和口腔是相同的，且RA患者腸道和口腔菌群失調(diào)，但在治療后會(huì)改善。,研究結(jié)果展示,連鎖基因群網(wǎng)絡(luò)圖,腸道、牙齒或唾液微生物能區(qū)分出RA患者與健康對(duì)照組。 RA患者腸道，唾液，牙齒的嗜血桿菌與血清抗體呈負(fù)相關(guān)，而唾液乳桿菌在RA患者三處都很活躍。 與RA患者氧化還原、運(yùn)輸和代謝的鐵、硫、鋅和精氨酸功能相關(guān)的微生物群改變。,每一個(gè)交點(diǎn)（MLG）來源于一個(gè)細(xì)菌，部分在健康人，部分在患者存在。

45、,研究結(jié)果展示,腸道微生物與口腔微生物關(guān)系MLG網(wǎng)絡(luò)圖,首次同時(shí)進(jìn)行口腔和腸道微生物菌群宏基因組對(duì)比關(guān)聯(lián)分析， 結(jié)果揭示了在人類重大慢性非感染性疾病中的機(jī)制，提示這種菌群異常在RA的病理生理機(jī)制中具有重要的作用，可能直接參與疾病發(fā)生。,多組學(xué)聯(lián)合分析,全面解析微生物群落功能,,多組學(xué)分析策略,環(huán)境微生物樣本,宏基因組測(cè)序,物種和功能基因,宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,差異基因表達(dá),相互關(guān)聯(lián)和驗(yàn)證,關(guān)鍵物種、基因、代謝通路等,,,16S/18S/IT

46、S等測(cè)序,3,群落組成與結(jié)構(gòu),測(cè)序技術(shù)及策略：腸道內(nèi)容物樣本技術(shù)：宏基因組測(cè)序宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（rRNA去除率達(dá)到95.05%）重復(fù)（replication）宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫糞便樣本技術(shù)：宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Illumina HiSeq 2500 PE150）組織學(xué)特征檢查,結(jié)腸炎中宿主和微生物互作轉(zhuǎn)錄響應(yīng)機(jī)制,Ilott N E, et al. ISME ,2016.,宏基因組&宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)小鼠腸道的功能profiling,

47、研究結(jié)果展示,不同樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)比較,復(fù)制、重組、修復(fù)在DNA層級(jí)上豐度最高的，因?yàn)樵揷ategory是普遍存在的，＞70%的屬都至少表達(dá)一個(gè)NOG 。但在RNA水平上卻表現(xiàn)不出來，這表明至少在取樣階段復(fù)制功能并不是最主要的轉(zhuǎn)錄活性。 在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝范疇中的NOGs是廣泛的表達(dá)的(~60% 的屬至少表達(dá)一個(gè)NOG)，這很有可能是該群落的重要功能，特別考慮到在這些屬是該類NOGs的豐度較高。,宏基因組數(shù)據(jù)表明門層級(jí)上

48、優(yōu)勢(shì)物種有Firmicutes和 Bacteroidetes,和其它的物種Proteobacteria 和 Actinobacteria。 宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：門層級(jí)優(yōu)勢(shì)物種是 Firmicutes 和 Bacteroidetes，這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了群落中活躍的物種，F(xiàn)irmicutes在轉(zhuǎn)錄層面占了大多數(shù)。,研究結(jié)果展示,DNA和轉(zhuǎn)錄層級(jí)上豐度差異的NOGs識(shí)別和鑒定,宿主基因的Luminal表達(dá)意味著先天免疫細(xì)胞的激活,采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)

49、結(jié)腸組織轉(zhuǎn)錄響應(yīng)情況。 第14天時(shí)小鼠出現(xiàn)了炎癥的病癥最為顯著，富集的基因包括在結(jié)腸炎發(fā)作的第6天時(shí)先天性免疫反應(yīng)發(fā)生上調(diào)，包括微生物防御在內(nèi)的基因。 與結(jié)腸炎發(fā)病期間的腔體抗菌性活性相一致，在腸道內(nèi)容物里AMPs (抗菌肽)也出現(xiàn)了顯著性的高表達(dá)量。,結(jié)腸炎中DNA和RNA水平上增加的基因顯出顯著富集的趨勢(shì)，這些基因參與無機(jī)離子傳輸。 半胱氨酸代謝通路的增加（谷胱甘肽的前體），這與人類IBD中推斷的功能相一致，與炎癥中谷胱甘肽的

50、抗氧化性質(zhì)密切相連。 谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶的DNA和轉(zhuǎn)錄豐度相對(duì)增加，這些酶類對(duì)于維持氧化還原環(huán)境和調(diào)控依賴谷胱甘肽過氧物酶活性十分重要。,基因組+轉(zhuǎn)錄組+蛋白組+代謝組,,微生物多組學(xué)研究方案,環(huán)境微生物樣本,16S/18S/ITS測(cè)序,物種種類和豐度,宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,基因差異表達(dá)與代謝通路,相互關(guān)聯(lián)和驗(yàn)證,關(guān)鍵物種、新物種、基因、代謝通路,,,宏基因組測(cè)序,功能基因和代謝特點(diǎn),,宏蛋白組、宏代謝組學(xué),活性物