用弗氏檸檬酸菌酶法合成l酪氨酸

1、項目四 用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,,目錄,L-酪氨酸L-酪氨酸的酶法合成弗氏檸檬酸菌的培養(yǎng)及破碎酪氨酸裂解酶的活力測定用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,L-酪氨酸,L-酪氨酸屬氨基酸的一種，結(jié)晶性粉末，無味，易溶于甲酸，難溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀鹽酸胡哦哦稀硝酸中溶解。從酪蛋白或玉米等含蛋白質(zhì)物質(zhì)的水解液中提取，是人體非必需氨基酸。醫(yī)藥上用作治療甲狀腺功能亢進(jìn)，也可做為食品添加劑。中文名稱:L-酪氨酸 中文

2、別名:L-β-對羥苯基-β-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-對羥苯基丙酸 英文名稱:L-Tyrosine 分子式:C9H11NO3 分子量:181.19,制備或來源：1.由含蛋白質(zhì)的物質(zhì)（廢絲、酪蛋白和玉米等）水解液中提??； 2.以葡萄糖為原料，經(jīng)短桿菌出發(fā)誘導(dǎo)的l-酪氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵而得； 3.以苯酚、丙酮酸、氨為原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。 用途：1.醫(yī)藥用作甲狀腺功能亢進(jìn)； 2.食品添加劑。 3.是一種重

3、要的生化試劑，是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。 4.廣泛用于農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，也作飲料添加劑和配制人工昆蟲飼料。,L-酪氨酸對皮膚的作用皮膚白不白，主要取決于黑色素細(xì)胞合成黑色素的能力。在人的表皮基層細(xì)胞間，分布著黑色素細(xì)胞，它含有的酪氨酶可以將酪氨酸氧化成多糖，中間再經(jīng)過一系列的代謝過程，最后便可生成黑色素。黑色素生成得多，皮膚就越黑；反之，則皮膚就越白皙。 研究證明，酪氨酸酶的活性與體內(nèi)的銅、鐵、鋅等元素密切相關(guān)

4、。經(jīng)常進(jìn)食富含酪氨酸和稀有元素鋅、銅、鐵的物質(zhì)，例如動物內(nèi)臟、腎，甲殼類動物蛤、蟹、河螺、牡蠣，水產(chǎn)品烏魚子，豆類的大豆、扁豆、青豆、赤豆，硬殼果類花生、核桃、黑芝麻以及葡萄干等，皮膚的色澤就較黑。因此住在海邊的人，打漁的漁民，由于吃以上水產(chǎn)品較多，因此皮膚色澤較黑。,L-酪氨酸的酶法合成,L-酪氨酸是目前仍采用水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一，應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L-酪氨酸是近年來氨基酸工業(yè)的研究熱點之一。酪氨酸酚裂解酶（tyrosin

5、e phenol-lyase），也稱β-酪氨酸酶，在生物體內(nèi)催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸而L-酪氨酸常作為營養(yǎng)增補劑、苯丙酮尿癥患者的必須氨基酸、對羥基苯乙烯等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料。,酪氨酸酚裂解酶主要分布于腸細(xì)菌內(nèi)，也存在于一些嗜熱菌和節(jié)肢動物體重，其中酶活較高的微生物主要是草生歐文氏菌、中間檸檬酸菌、弗氏檸檬酸以及嗜熱菌和Symbi-obacterium toebii等

6、。近年來，來源于上述微生物的TPL，其空間結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制已得到較深入研究，并在工業(yè)化應(yīng)用方面取得重要進(jìn)展。,弗氏檸檬酸菌的培養(yǎng)及破碎,弗氏檸檬酸桿菌隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)。該菌革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧，為條件致病菌，廣泛分布于自然界中，是人和動物(哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類)腸道內(nèi)正常的菌群。藥物敏感性試驗結(jié)果表明，該菌對氟羅沙星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、依

7、諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7種抗生素高度敏感。,特征特性：革蘭陰性桿菌，有周鞭毛，能運動，無芽胞，無莢膜。具有氨芐青霉素（Ampr）、卡那霉素（Kanr）、四環(huán)素（Tcr）及鏈霉素（Strr）抗性。光滑、低凸、溫潤、半透明或不透明，表面有光澤，邊緣不整齊。菌體桿狀，直徑1.0，長2—6μm。菌落直徑2—4mm。出芽繁殖為主，酒類增香。用于白酒增香?？梢院?0ppm MG的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中正常生長，最適生長溫度為30℃。,實驗材料：菌

8、株：弗氏檸檬酸菌（Citrobacter freundii)試劑：LB培養(yǎng)基：配方：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、瓊脂 15~20g 、水 1000mL（調(diào)節(jié)pH 7.4~7.6）,實驗操作,1.菌種培養(yǎng)：配制培養(yǎng)基菌種活化待滅菌后的固體培養(yǎng)基冷卻至50℃時，倒入平板中（大約每平板15mL），待平板凝固后，挑取菌種進(jìn)行劃線接種。接種好的平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。

9、擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取上面培養(yǎng)好的菌落，放入已滅菌好的液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。37℃、200r/min搖床過夜培養(yǎng)。（培養(yǎng)時間不能太長，否則細(xì)菌老化，代謝產(chǎn)物太多）,2.破碎細(xì)胞菌體收集：取已經(jīng)培養(yǎng)過夜的弗氏檸檬酸菌菌懸液于離心管中，3000r/min離心5min，棄上清液，收集菌體。細(xì)胞破碎：向離心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）緩沖液（1:20），在漩渦混合器混合。然后再超聲破碎儀下破碎，功率和時間根據(jù)菌液多少確定。

10、功率不得太高，不要起氣泡。循環(huán)次數(shù)不要太多，運行2s，間歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎前為乳白色，破碎后為透明。收集破碎液：將破碎好的液體倒入離心管中離心，3000r/min離心5min。棄沉淀，上清液備用。,酪氨酸酚裂解酶的活力測定：福林酚試劑時磷鉑酸與磷鎢酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸中的酚基還原，生成鉑藍(lán)、鎢藍(lán)的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與福林酚試劑反應(yīng)，所生成的藍(lán)色化合物可用比色法測定。,

11、用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一，收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重，應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L-酪氨酸具有重要的應(yīng)用價值。用TPL合成L-酪氨酸，首先開展的工藝是丙酮酸路線。,Para等將包埋于聚丙烯酰胺凝膠中的C.intermiedius固定化細(xì)胞作為催化劑，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸鈉、45mmol/L硫酸銨、45mmol/L氯化銨和55mmol/L苯酚的轉(zhuǎn)化體系，反應(yīng)5h后可積累

12、L-酪氨酸10g/L。若將反應(yīng)體系置于連續(xù)的柱反應(yīng)器內(nèi)，苯酚對L-酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，且穩(wěn)定性可維持5d。,酶法合成產(chǎn)物L(fēng)-酪氨酸的分析鑒定,實訓(xùn)原理：紙層析法是利用各物質(zhì)不同的分配系數(shù)，使混合物隨流動相時而得到分離的方法。紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的。濾紙纖維與水親和力較強，而與有機(jī)溶劑親和力弱，所以紙層析以濾紙纖維和結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑為流動相。當(dāng)有機(jī)相沿濾紙流動經(jīng)過樣品點時，樣品點上的溶液在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分

13、配，樣品移動速率與樣品的極性及水親和力有關(guān)，因此，極性氨基酸移動較慢，而非極性氨基酸移動較快。,實訓(xùn)器材及試劑：層析缸、毛細(xì)管：5只/組、培養(yǎng)皿：1只/組、層析濾紙（長16cm、寬16cm的）：1張/組、直尺、鉛筆、電吹風(fēng)、針、白線、小試管：4只/組、移液管、噴霧器。,1.展層劑和平衡液：正丁醇：冰醋酸：水=4:1:5，充分搖勻，用分液漏斗取上層做展層劑；下層液（棄去）。2.樣品液：用水配成酶1mL含有絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸各m

14、g/mL的氨基酸溶液，以及上述四種氨基酸的混合液（各4mg/mL）3.茚三酮：按展層劑0.25%的比例將茚三酮加入展層劑中，使其溶解。,實訓(xùn)操作：1.檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。2.規(guī)劃：取寬約16cm、高約16cm的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線A，在直線上做4個記號，記號之間隔2cm，這就是原點的位置。另在距左邊緣1cm處劃一條平行于左邊緣的直線

15、B，在B線以上A、B兩線的交點為原點標(biāo)明刻度（以厘米為單位）。,3.點樣：在每個圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號（混合樣可寫M），然后用毛細(xì)管吸取樣品，輕輕地點到相應(yīng)的氨基酸圈內(nèi)，待晾干或冷風(fēng)吹干后再點第二次。前三種氨基酸各點3次，混合液點6次。將點過樣的濾紙用針線卷成筒狀（點樣面向內(nèi)），注意紙的兩邊不能接觸，留一定縫隙。注意：點樣用的毛細(xì)管和試劑瓶上的氨基酸是一一對應(yīng)的，千萬不能混淆，以免污染。,4.層析：將培養(yǎng)皿中放入2/3量的展層

16、劑，迅放置于層析缸中。把濾紙筒轉(zhuǎn)移到此培養(yǎng)皿內(nèi)，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點。當(dāng)溶劑前言到達(dá)濾紙2/3處，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿。注意：點樣端朝下，點樣處不能沒入層析液中，濾紙不能貼壁。顯色：熱風(fēng)吹干濾紙至顯出氨基酸斑點，用鉛筆描出輪廓。,參考文獻(xiàn),[1]楊金奎,何璧梅.微生物方法生產(chǎn)L-半胱氨酸的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥(抗生素分冊).2001(04);[2]薛文華.電化學(xué)法制備L-半胱氨酸的研究[J].廣州

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