盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

1、盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1．學(xué)習(xí)盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。 2．掌握盤(pán)狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。 3．比較醋酸纖維素薄膜電泳與聚丙烯酰胺凝膠 電泳分離血清蛋白質(zhì)的效果。,二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)又稱為共聚體的N，N一甲叉雙

2、丙烯酰胺(methyleme—bisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。由于這種凝膠具有分子篩的性質(zhì)，所以對(duì)樣品的分離作用不僅決定于樣品的各組分所帶的電荷的多少，而且也與分子的大小有關(guān)。其次，此凝膠電泳還有一種獨(dú)特的濃縮效應(yīng)，因而較醋酸纖維薄膜電泳，瓊脂糖電泳等具有更高的分辨率。,在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好，化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，幾乎無(wú)電滲作用，樣品不易

3、擴(kuò)散，用量少(1～100μg)等優(yōu)點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠電泳應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可以測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等。,(一)聚合反應(yīng) 聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化劑過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate，(NH4)2S2O8簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin，即vitaminB2，C17H20O6N4)和加速劑N，N，N’，N’一四甲基乙二胺(N，N，

4、N，N’一tetramethyl ethytenediamine，簡(jiǎn)稱TEMED)的作用下，聚合而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。催化劑和加速劑的種類很多，目前常用的有2種催化體系。1.AP—TEMED 化學(xué)聚合作用 TEMED 是一種脂肪族叔胺，其堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)cr單體形成單體長(zhǎng)鏈，在Bis作用下聚合成凝膠。,2．核黃素一TEMED 光聚合作用 TEMED可加速

5、凝膠的聚合，但不加也可聚合。光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能發(fā)生，因?yàn)楹它S素在TEMED及光照條件下，還原成無(wú)色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。但過(guò)量氧會(huì)阻止鏈長(zhǎng)的增加，因此應(yīng)避免過(guò)量氧的存在。 用核黃素進(jìn)行光聚合的優(yōu)點(diǎn)是：核黃素用量少(1 mg／100 m1)，不會(huì)引起酶的鈍化或蛋白質(zhì)生物活性的喪失；通過(guò)光照可以預(yù)定聚合時(shí)間，但光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變小，不太穩(wěn)定，所以用

6、它制備濃縮膠(大孔膠)較合適。,聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electrophoresis簡(jiǎn)稱PAGE)根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；后者在電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH值、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均

7、較前者佳。目前常用的多為垂直的圓盤(pán)及板狀兩種。,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成，它們?cè)谥绷⒌牟ＡЧ苤?或2層玻璃板中)排列順序依次為上層濃縮膠(大孔膠)、下層分離膠(小孔膠) 。濃縮膠是核黃素催化聚合而成的大孔膠，分離膠是由AP催化聚而成的小孔膠，T=7．O％～7．5％，C=2.5％。凝膠緩沖液為pH8.9 Tris—HCl，大部分血清中各種蛋白質(zhì)在此 pH條件下，按各自負(fù)電荷量及相對(duì)分子質(zhì)量泳動(dòng)，此膠主要起分子篩作用。,

8、濃縮效應(yīng)：由于緩沖體系中pH值選擇不一(濃縮膠緩沖液pH6．7，電極緩沖液pH8．3)導(dǎo)致HCl中Cl-幾乎全部解離，甘氨酸中僅O.1％～l％解離為NH2CH2COO-，而蛋白質(zhì)在這種酸堿度中也解離為蛋白質(zhì)一COO-。這三種帶負(fù)電荷的離子在電泳時(shí)，同時(shí)向正極泳動(dòng)，但泳動(dòng)率不同。Cl-離子泳動(dòng)最快而居先，稱“前導(dǎo)離子”(1eading ion)， NH2CH2COO-離子最慢而殿后，稱“尾隨離子”(trailing ion)。這樣，在快

9、離子的后面形成一條離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，從而產(chǎn)生較高的電壓梯度而加速了蛋白質(zhì)的泳動(dòng)。又因蛋白質(zhì)的泳動(dòng)率介于快慢離子之間得以被濃縮為一條狹窄的盤(pán)形帶。,電荷效應(yīng)：蛋白質(zhì)在界面上被高度濃縮后，雖形成一條狹帶，但因其中每一組分所帶荷電量不一，因而泳動(dòng)率也有差異，這就使其各組分按一定順序形成若干圓盤(pán)。分子篩效應(yīng)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)夾在快慢離子間通過(guò)隔層進(jìn)入分離膠時(shí)，尾隨離子由于凝膠的pH值與孔徑的突變導(dǎo)致進(jìn)一步解離而增速以至超過(guò)蛋白的泳動(dòng)率，使高電區(qū)梯

10、度不復(fù)存在。然而蛋白質(zhì)在這種均一的電壓梯度的條件下，因其各組分的相對(duì)分子質(zhì)量或構(gòu)型不同，在通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí)，必然受阻程度不同。這種分子篩效應(yīng)，使之泳動(dòng)率仍有差異而得以分離。,本實(shí)驗(yàn)采用垂直管型分析盤(pán)狀電泳。凝膠柱用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺在垂直的玻璃小管中聚合而成。蛋白樣品液放在凝膠柱頂端。整個(gè)系統(tǒng)用多相(不連續(xù))緩沖液。當(dāng)電場(chǎng)通過(guò)垂直的凝膠柱時(shí)，樣品成分就根據(jù)它所帶的電荷、分子的大小、形狀，以特定的泳動(dòng)率遷移分離成帶(盤(pán)狀)。電泳

11、后，取出凝膠柱作固定和染色處理，顯示特定蛋白質(zhì)的位置。,三、操作步驟1.準(zhǔn)備工作2.分離膠（小孔膠）的制備 在干凈的50ml小燒杯中，分別加入①液1ml；②液2ml，蒸餾水1ml；③液4ml，輕輕搖勻。然后用長(zhǎng)滴管吸取此液加入玻璃管中，沿玻管壁緩緩注入蒸餾水，水層3～5mm高，加蒸餾水的目的是防止空氣中的氧妨礙凝膠的形成，以及消除液柱表面的彎月面。,3．濃縮膠(大孔膠)的制備 在小燒杯中，分別加入

12、④液1 ml，⑤液2 ml，蒸餾水1ml，⑥液4 ml，輕輕搖勻，然后放在暗處。 將已制成分離膠的玻管倒立于濾紙上除去水，再用濾紙條吸去殘留的水，注意不要碰到膠面。用滴管吸少量的濃縮膠液洗一下凝膠頂。然后把此凝膠管垂直插在一個(gè)支架上(這個(gè)支架可用一塊木板，上面釘兩個(gè)釘子，長(zhǎng)釘之間套兩道橡皮筋制成)，用滴管加上述濃縮膠1.0cm高，上面加水層，操作同分離膠制備。 把以上固定在木板上的凝膠

13、管移至日光燈下(距管lO cm高)照射，進(jìn)行光聚合。開(kāi)始顯淡黃色，5～6 min后逐漸轉(zhuǎn)乳白色，表明聚合開(kāi)始，繼續(xù)光照20～30 min，使聚合完全。,4.加樣 倒去凝膠上覆蓋的水層，并用濾紙條吸去沾在管壁上的水，再用電極緩沖液洗滌一下膠頂，然后輕輕去除下端膠布，再用電極緩沖液洗去蔗糖液。把凝膠管插到電泳槽的橡皮圈內(nèi)，注意垂直。電泳槽的下槽先灌注電極緩沖液(注意把母液稀釋10倍)約200 ml，再把上槽安置到下槽上，注

14、意凝膠管下端不要有氣泡，如有氣泡用玻棒輕輕敲玻管即可驅(qū)除氣泡。用1ml注射器吸50 ul樣品液（含0.1％溴酚藍(lán)指示劑），沿管壁加到濃縮膠頂上，加樣針頭離膠頂1 mm處，勿碰到膠面。然后用滴管沿管壁加電極緩沖液至管頂。最后，在上極槽中倒入電極緩沖液約150 ml。,5．電泳 電泳槽上槽接負(fù)極、下槽連正極，然后通電。先恒流：開(kāi)始用1～2 mA／管，電泳30 min后調(diào)至恒壓，電壓為290～300 V(即50 V／管)。

15、電泳過(guò)程中要保持電壓穩(wěn)定，否則電壓過(guò)高會(huì)造成發(fā)熱，使分離失敗。 通電2．5 h左右，待溴酚藍(lán)指示液離管底1 cm處停止電泳，取出凝膠管。6．剝膠 用一長(zhǎng)針頭注射器吸滿水，將針頭插入凝膠與管壁之間，慢慢旋轉(zhuǎn)玻管，一邊壓入水，一邊使針頭慢慢呈螺旋式地前進(jìn)，靠水流壓力和潤(rùn)滑力將玻管內(nèi)壁與凝膠分開(kāi)，最后用吸耳球在玻管一端輕輕加壓，或用針輕輕壓凝膠條，使其滑在干凈的燒杯中。剝膠時(shí)注意不要損傷凝膠表面。,7

16、．染色、漂洗 燒杯中加人氨基黑染色液，在90℃水浴中加熱約5min。先用蒸餾水漂洗去膠條表面的染色液，然后再在燒杯中倒入7%醋酸漂洗液，經(jīng)常更換漂洗液，漂洗2～3天直至背景顏色去除為止。 漂洗凈的膠條可放入裝有7%醋酸溶液的試管中保存，以備鑒定和照相。 8．結(jié)果觀察與繪圖,四、實(shí)驗(yàn)建議 電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向移動(dòng)。電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電