蛋白質的結構與功能01

1、蛋白質的結構與功能,第1章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白質?,蛋白質(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,蛋白質研究的歷史,1833年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中分離到類似胃蛋白酶的物質。1864年，血紅蛋白被分離并結晶。19世紀末，證明蛋白質由氨基酸組成，并合成了多種短肽。20世紀初，發(fā)現(xiàn)

2、蛋白質的二級結構；完成胰島素一級結構測定。,20世紀中葉，各種蛋白質分析技術相繼建立，促進了蛋白質研究迅速發(fā)展；1962年，確定了血紅蛋白的四級結構。20世紀90年代，功能基因組與蛋白質組研究地展開。,蛋白質的生物學重要性,分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。,1. 蛋白質是生物體重要組成成分,

3、作為生物催化劑（酶）代謝調(diào)節(jié)作用免疫保護作用物質的轉運和存儲運動與支持作用參與細胞間信息傳遞,2. 蛋白質具有重要的生物學功能,3. 氧化供能,蛋白質的分子組成The Molecular Component of Protein,第一節(jié),組成蛋白質的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白質含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘 。,各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％。,由于體內(nèi)的含氮

4、物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質的大致含量：,100克樣品中蛋白質的含量 (g %)= 每克樣品含氮克數(shù)× 6.25×100,1/16%,蛋白質元素組成的特點,一、組成人體蛋白質的20種氨基酸均屬于L-?-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且均屬 L-?-氨基酸（Gly，Pro除外）。,,C,,+,N,H,3,,,,,

5、,,,,C,O,O,-,,H,非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,二、氨基酸可根據(jù)側鏈結構和理化性質進行分類,(一)側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,(二)側鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸,(三)側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸,(四)側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸,(五)側鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸,幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,? 半胱氨酸,胱

6、氨酸,三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質,兩性解離及等電點,氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,（一）氨基酸具有兩性解離的性質,pH=pI,pH>pI,pH<pI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,（二）含共軛雙

7、鍵的氨基酸具有紫外吸收性質,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（三）氨基酸與茚三酮反應生成藍紫色化合物,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,四、蛋白質是由許多氨基酸殘基組

8、成的多肽鏈,肽鍵(peptide bond)是由一個氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,（一）氨基酸通過肽鍵連接而形成肽 (peptide),+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……,肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptid

9、e)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽鏈中有游離α-氨基的一端C 末端：多肽鏈中有游離α-羧基的一端,多肽鏈有兩端：,多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,蛋白質的分子結構The Molecular Structure of Protein,第二節(jié),蛋白質的分子結構包括:,一級結構(primary struc

10、ture)二級結構(secondary structure)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structure),定義:蛋白質的一級結構指在蛋白質分子從N-端至C-端的氨基酸排列順序。,一、氨基酸的排列順序決定蛋白質的一級結構,主要的化學鍵:肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎，但不是決定蛋白質空間構象的唯一因素。,二、多肽鏈的局部主

11、鏈構象為蛋白質二級結構,主要的化學鍵：氫鍵,（一）參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上,參與肽鍵的6個原子C?1、C、O、N、H、C?2位于同一平面，C?1和C?2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,?-螺旋 (? -helix) ?-折疊 (?-pleated sheet) ?-轉角 (?-turn) 無規(guī)卷曲 (random coil)

12、,（二）α-螺旋結構是常見的蛋白質二級結構,蛋白質二級結構,?-螺旋,（二）?-折疊（ ?-片層）,（四）?-轉角和無規(guī)卷曲在蛋白質分子中普遍存在,?-轉角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。,,（五）模體是具有特殊功能的超二級結構,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結構組合，被稱為超二級結構。,二級結構組合形式有3種：αα，βαβ，ββ 。,二個或三個具有二級

13、結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，稱為模體(motif) 。,模體是具有特殊功能的超二級結構。,,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體,鋅指結構,α-螺旋-β轉角（或環(huán)）-α-螺旋模體鏈-β轉角-鏈模體鏈-β轉角-α-螺旋-β轉角-鏈模體,模體常見的形式,三、在二級結構基礎上多肽鏈進一步折疊形成蛋白質三級結構,整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義:,（一）三級結構是指整條肽

14、鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置,肌紅蛋白 (Mb),,亞基之間的結合主要是氫鍵和離子鍵。,四、含有二條以上多肽鏈的蛋白質具有四級結構,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。,有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基 (subunit)。,由2個亞基組成的蛋白質四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結構不同，

15、則稱之為異二聚體(heterodimer)。,血紅蛋白的四級結構,蛋白質結構與功能的關系The Relation of Structure and Function of Protein,第三節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、蛋白質一級結構是高級結構與功能的基礎,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,（二）一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構與功能,（四）重要蛋白質的氨

16、基酸序列改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基,血紅素結構,二、蛋白質的功能依賴特定空間結構,（一）血紅蛋白亞基與肌紅蛋白結構相似,肌紅蛋白(myoglobin，Mb),肌紅蛋白是一個只有三級結構的單鏈蛋白質，有8段α-螺旋結構。血紅素分子中的兩個丙酸側鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+

17、形成配位結合，所以血紅素輔基與蛋白質部分穩(wěn)定結合。,血紅蛋白(hemoglobin，Hb),血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結構，每個亞基可結合1個血紅素并攜帶1分子氧。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白亞基構象變化可影響亞基與氧結合,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白

18、(Hb)的氧解離曲線,,,血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,變構效應(allosteric effect),蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。,協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity

19、)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(negative cooperativity),（三）蛋白質構象改變可引起疾病,蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、

20、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,瘋牛病中的蛋白質構象改變,第四節(jié),蛋白質的理化性質The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白質具有兩性電離的性質,蛋白質分子除兩端的氨

21、基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,蛋白質的等電點( isoelectric point, pI),二、蛋白質具有膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。,顆粒表面電荷水化

22、膜,蛋白質膠體穩(wěn)定的因素:,水化膜,－,,－,－,－,－,－,－,－,帶負電荷的蛋白質,溶液中蛋白質的聚沉,三、蛋白質空間結構破壞而引起變性,在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,蛋白質的變性(denaturation),造成變性的因素:如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例:臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用

23、來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation) 。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性

24、。,蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,蛋白質沉淀,蛋白質的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白質在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。,蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)

25、紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,五、應用蛋白質呈色反應可測定蛋白質溶液含量,茚三酮反應(ninhydrin reaction),雙縮脲反應(biuret reaction),五、蛋白質的分類,根據(jù)蛋白質組成成分:,根據(jù)蛋白質形狀:,第五節(jié),蛋白質的分離純化與結構分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,

26、分離純化的一般原則：,前處理：把蛋白質以溶解狀態(tài)從組織/細胞中 釋放出來，并保持天然狀態(tài)粗分離：目的蛋白質和其他蛋白質分離細分離：進一步提純，結晶,一、透析及超濾法可去除蛋白質溶液中的小分子化合物,應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,透析(dialysis),超濾法,利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。,二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質沉淀方法,使

27、用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原

28、蛋白。,三、利用荷電性質可用電泳法將蛋白質分離,蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。,幾種重要

29、的蛋白質電泳:,四、應用相分配或親和原理可將蛋白質進行層析分離,待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的。,層析(chromatography)分離蛋白質的原理,離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質分

30、子大小不同分離。,蛋白質分離常用的層析方法,五、利用蛋白質顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離,超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。,因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的

31、大多數(shù)纖維狀蛋白質不適用。,六、應用化學或反向遺傳學方法可分析多肽鏈的氨基酸序列,分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別進行分析,測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。,,,,,通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列

32、,分離編碼蛋白質的基因,測定DNA序列,排列出mRNA序列,,,,七、應用物理學、生物信息學原理可進行蛋白質空間結構測定,二級結構測定通常采用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198 nm處的正峰三個成分；而?-折疊的CD譜不很固定。,三級結構測定X射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技術(nu

33、clear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。,同源模建：將待研究的序列與已知結構的同源蛋白質序列對齊——補償氨基酸替補、插入和缺失——通過模建和能量優(yōu)化計算，產(chǎn)生目標序列三維結構。序列相似性越高，預測的模型也越準確。折疊識別：通過預測二級結構、預測折疊方式和參考其它蛋白的空間結構，從而產(chǎn)生目標序列的三維結構。從無到有：根據(jù)單個氨基酸形成二級結構的傾向，加上各種作用力力場信息，直接