蛋白質(zhì)的結構

1、二、蛋白質(zhì)的結構,蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈結合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。（20種aa的平均分子量為110）蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到1’000’000道爾頓甚至更大。,§1.3蛋白質(zhì)的分類及化學結構,1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結構可以分成四個層次:primary s

2、tructure 一級結構： 氨基酸序列secondary structure 二級結構： α螺旋，β折疊tertiary structure 三級結構： 所有原子空間位置 quanternary structure 四級結構： 蛋白質(zhì)多聚體 1969年正式將一級結構定義為氨基酸序列和二硫鍵的位置。 介于

3、二級結構和三級結構之間還存在超二級結構（二級結構的組合）和結構域（在空間上相對獨立的三維結構實體）這兩個層次。,蛋白質(zhì)的結構層次,1 多肽,一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。,多肽的結構,由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。,肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾相連,肽鏈中的肽平面,,肽鍵平面,肽鍵,肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與

4、羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結構存在。,,兩個肽平面以一個Cα為中心發(fā)生旋轉(zhuǎn),在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為多肽的氨基酸順序。通常在多肽鏈的一端含有一個游離的?-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的?-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列

5、順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln多肽的命名取從N-端的氨基酸殘基開始，稱：某氨酰某氨酰┅ ┅某氨基酸。,四肽的結構,多肽的性質(zhì),（1）. 多肽的兩性離解 肽在水溶液中是以兼性離子存在的,肽的亞氨基不能解離，因此肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈 N端和C端的自由NH2、自由羧基以及R基上可解離的官能團。,多肽的性質(zhì),（2）.pK值和pH值 肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.

6、肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，R基的解離和氨基酸差不多。 pI：肽所帶的凈電荷為零時溶液的pH。 小肽（2—5肽）的pI值的求法，先寫解離式，找兩性離子，把兩性離子兩邊的pK值相加除2即得。大肽不能用此法求。,（3）.旋光性 蛋白質(zhì)水解所得的各種肽，酶解時不發(fā)生消旋，就具有旋光性。 一般短肽的旋光度約等于組成該肽的各個氨基酸旋光度之和. 大肽和蛋白質(zhì)的旋光度一般大于組成該肽的各

7、個氨基酸旋光度之和.,多肽的性質(zhì),(4) 顏色反應,多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應。這些顯色反應，可用于多肽的定性或定量鑒定。如茚三酮反應、考馬斯亮藍反應。黃色反應，是由硝酸與氨基酸的苯基（Tyr、Phe和Trp）反應生成硝基苯衍生物而顯黃色。,多肽的性質(zhì),硝基酚(黃色) 鄰硝醌酸鈉(橙黃色),多肽的雙縮脲反應是多肽特有的顏色反應;雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲能夠與堿性硫酸

8、銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡合物，稱為雙縮脲反應。含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結構特點，也能發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色或藍紫色絡合物。這是多肽定量測定的重要反應。,尿素 雙縮脲 紫紅色絡合物,天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的肽以游離狀態(tài)存在。這類肽通常都具有特殊的生理功能

9、，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ?

10、 ? L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu  短桿菌肽S(環(huán)十肽)  由細菌

11、分泌的多肽，有時也都含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine, 縮寫為 Orn）。,習題：,等電點計算： 有一個蛋白質(zhì)擁有30個側鏈羧基（pKa 4.3），10個咪唑基團（pKa 7.0），15個 ε-氨基（pKa 10.0）。 求該蛋白質(zhì)的等電點。,2 蛋白質(zhì)的一級結構,蛋白質(zhì)的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸

12、順序。多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質(zhì)的一級結構。,1 樣品必需純（>97%以上）；2 知道蛋白質(zhì)的分子量；3 知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；4 測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。5

13、 測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。,測定蛋白質(zhì)的一級結構的要求,蛋白質(zhì)和多肽氨基酸順序的測定,(1)、肽鏈的拆開和分離 (2)、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 (3)、二硫鍵的斷裂 (4)、測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比 (5)、N端、C端的測定 (6)、多肽鏈斷裂 (7)、測定每個肽段的氨基酸順序。 (8)、確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)、確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。,酸水解,常用6

14、mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基被水解成了羧基。,堿水解,一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受

15、破壞。,酶水解,目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。應用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。,測定步驟,(1) 多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,測定步驟,幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L

16、尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).,蛋白質(zhì)一級結構的測定,測定步驟,(2) 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,測定步驟,(3) 二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的?-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，

17、以防止它重新被氧化。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,二硫鍵的切割與保護,1、過甲酸〔performic acid〕 不可逆 －CH2SO3H2、還原＋氧化 不可逆 [ 巰基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等 －S-CH2-COOH3、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

18、 －R1-S-S-R2 ＋ HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3,測定步驟,可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,,作用：這些反應可用于巰基的保護。,巰基（-SH）的保護,(4)測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；,蛋白質(zhì)一級結構的測定,測定步驟,(5)分析多肽鏈的N-末端和C

19、-末端。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸測定,N末端：1、Sanger法2、Edman法3、DNS-Cl4、酶降解法,C末端：1、肼解法2、酶降解法3、硼氫化鋰法,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作

20、用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。,末端氨基酸測定,① 二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger試劑(DNFB)標記N末端,② Edman 降解法(I),Edman 降解法(II),氨基酸的鑒定、分離純化,PTH-AA,在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點

21、是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到1?10-9mol。,末端氨基酸測定,③ 丹磺酰氯法,氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個地向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。,末端氨基酸測定,④ 氨肽酶法,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法

22、。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。,末端氨基酸測定,⑤ 肼解法,羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根具不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Ar

23、g和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵；Y都能水解。,末端氨基酸測定,⑥ 羧肽酶法,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽C-端氨基酸可被硼氫化鋰還原成α-氨基醇，用層析法可以鑒定氨基酸種類。,末端氨基酸測定,⑦ 硼氫化鋰,N末端和C末端的測序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級結構的研究以外，最常用于基因工程表達產(chǎn)物的末端分析。,測定步驟,(6) 多肽鏈斷裂成多個肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將

24、多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶,酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,Pepsin：R1和R2＝苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr); 亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1不能為Pro。

25、,肽鏈,水解位點,胃蛋白酶,肽鏈,水解位點,嗜熱菌蛋白酶,thermolysin：R3=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2和 R4不能為Pro。,? 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,? 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,? 化學法 (Cyanogen bromide) ： 溴化氰水解法，它能

26、選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。,多肽鏈的選擇性降解,測定步驟,(7)測定每個肽段的氨基酸順序。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 結論：A B C D E,FDNB,FDNB,完

27、全水解,部分水解,一般測定步驟,(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 重疊法 －－－－－－－－－－－－－ 多肽↓ →→→→→ →→→→ →→→→→→ →→→→↓ 氨基酸序列,蛋白質(zhì)一級結構的測定,一般測定步驟,(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位

28、置。,蛋白質(zhì)一級結構的測定,,,,,,,,,,,,,一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。,二硫鍵位置的確定,蛋白質(zhì)一級結構的實例,蛋白質(zhì)中氨基酸順序的測定 用幾種酶或試劑把蛋白質(zhì)水解成大小不同的片段，找出重疊部分，確定順序。例1：有一個九肽，

29、 用胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,(2) Thr-Phe-Val-Lys; 用糜蛋白酶水解得到: (3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp, (4)Thr-Phe, (5)Gly-Lys; 確定此九肽的氨基酸順序。,順序為：Thr-Phe-Val-Lys- Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,例2：有一肽鏈，用下述試劑降解后，結果如下：,1、酸解:(1)（

30、Ala,Asp,Glu2,Lys2,Met,Phe)2、羧肽酶A:(2)第一次降解出的aa是Glu3、胰蛋白酶:(3)(Glu,Lys) (4)(Asp,Lys,Phe) (5)(Ala,Glu,Met)4、CNBr水解: (6)(Asp,Glu,Lys2,Met,Phe) (7)(Ala,Glu)5、糜蛋白酶:(8)(Glu,Lys,Phe) (9)(Ala,Asp,Glu,Lys,Met),解: (1) 表明此肽是一個八肽

31、 (2) C端的氨基酸是Glu (3) Glu-Lys- (4)_ _ Lys(胰蛋白酶) (5)_ _ Glu(位于C端) (6)_ _ _ _ _-Met (7)由(5)可知Met-Ala-Glu (8)由(3)可知Glu-Lys-Phe (9)由(7)可知_ _ -Met-Ala-Glu,由(

32、8)知Glu-Lys-Phe,所以,(4)順序為:Phe-Asp-Lys,此肽的aa順序為:Glu-Lys-Phe- Asp-Lys -Met-Ala-Glu,例3：有一肽鏈，用下述試劑降解后，結果如下：,1、酸解:(1) Ala2,Arg,Lys2,Met,Phe,Ser22、羧肽酶A :(2)第一次降解出的aa是Ala3、胰蛋白酶:(3)(Arg,Ala) (4)(Lys,Phe,Ser) (5)(Lys) (6)(Ala,Me

33、t,Ser)4、CNBr水解: (7)(Ala,Arg,Lys2,Met,Phe,Ser) (8)(Ala,Ser)5、嗜熱菌蛋白酶:(9)(Ala,Arg,Ser) (10)(Ala,Lys2,Met,Phe,Ser),解: (1) 此肽是一個9肽 (2) C端的氨基酸是Ala (3) Ala-Arg- (4)_ _ Ly

34、s (5)Lys前面的AA是Lys或Arg (6)由(2)(3)(8)知Met-Ser-Ala (7)_ _ _ _ _ _Met (8)由(2)(3)知Ser-Ala (9)由(3)Ser在Ala-Arg之后，為Ala-Arg-Ser (10)由(5)(6) 知Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala,次肽的aa順序為: Ala-A