BmNPV膜融合蛋白GP64作用機(jī)制初步研究.pdf

1、桿狀病毒是雙鏈DNA病毒的一個大家族，該病毒主要感染鱗翅目、雙翅目、膜翅目昆蟲及甲殼類動物，區(qū)別于其它病毒的顯著性特征是它具有雙相復(fù)制周期，其生活周期中產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)與功能不同的病毒粒子：出芽病毒（BV）和包涵體病毒（ODV）。家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒屬的代表成員，雖然關(guān)于其感染的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但仍有許多問題需要進(jìn)一步解決，本論文主要對GP64及膽固醇介導(dǎo)BmNPV BV入侵細(xì)胞機(jī)制及GP64信號

2、肽特性作了進(jìn)一步的研究，以揭示膜融合蛋白 GP64膽固醇識別序列(CRAC)與膽固醇的相互作用是BV入侵細(xì)胞的關(guān)鍵，同時也證明了GP64信號肽在引導(dǎo)GP64跨膜轉(zhuǎn)運后并沒有發(fā)生切割。本研究豐富了桿狀病毒感染分子機(jī)制的理論。
　　本論文主要從以下幾個方面研究GP64與膽固醇介導(dǎo)BmNPV BV入侵細(xì)胞的分子機(jī)制：BmNPV GP64序列分析及信號肽特性分析、BmNPVgp64缺失病毒的構(gòu)建、BmNPV GP64CRACs分析及與膽固

3、醇互作探究。這些研究結(jié)果為后期闡述BmNPV入侵細(xì)胞機(jī)制提供參考。
　　1）BmNPV GP64序列分析及信號肽特性分析：BmNPVgp64全長1593 bp，編碼530個氨基酸，其N端信號肽序列為38個氨基酸殘基。通過序列比對發(fā)現(xiàn) BmNPV GP64與AcMNPV GP64的同源性達(dá)到93％；在BmNPV GP64信號肽內(nèi)部加上c-Myc-Tag，再轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過western blot驗證BmNPV GP64信號肽在完

4、成跨膜轉(zhuǎn)運后是否被切割。
　　2）BmNPV gp64缺失病毒的構(gòu)建：利用同源重組的方法將打靶DNA分子通過電擊轉(zhuǎn)化到Red重組系統(tǒng)中，通過兩種抗性篩選陽性克隆。設(shè)計鑒定引物及缺失基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的缺失病毒重新構(gòu)建新的Bac-to-Bac系統(tǒng)。該成果將為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　3）BmNPV GP64 CRACs分析及與膽固醇互作探究：通過序列比對發(fā)現(xiàn)，AcMNPV GP64含有3個CRACs，而BmN