NIRF蛋白對HBV核心蛋白的作用及其機制的初步研究.pdf

1、目的
　　研究NIRF蛋白對HBV核心蛋白的作用及其機制。探索NIRF是否是HBc的一個E3 ligase。NIRF是否與HBc在細胞內相互結合，從而導致HBc的泛素化降解。探討NIRF對HBc表達和HBV復制、分泌的影響。
　　方法
　　1.以pIRES2-EGFP-NIRF為模板，PCR法擴增NIRF基因編碼區(qū)序列，將其克隆至pCMV-Myc真核表達載體中，構建重組真核表達質粒pCMV-Myc-NIRF。將其轉染H

2、EK293細胞，用Western blotting方法檢測NIRF的表達。以pCMV-Core為模板，PCR法擴增HBc基因編碼區(qū)序列，將其克隆至pcDNA3真核表達載體中，構建重組真核表達質粒pcDNA3-HBc。將其轉染HEK293細胞，用Western blotting方法檢測HBc的表達。全基因合成泛素基因序列，構建pcDNA3-UB質粒。
　　2.在HEK293細胞和HepG2.2.15細胞內進行NIRF與HBc的免疫熒

3、光共定位實驗。
　　3.在HEK293和HepG2.2.15細胞內進行NIRF與HBc免疫共沉淀實驗。研究NIRF與HBc在細胞內的相互作用。
　　4.在HEK293細胞內，進行NIRF導致HBc降解的動力學分析。在HEK293細胞內，進行泛素化研究，確定其降解是否是泛素化降解。
　　5.在HepG2.2.15細胞中，上調或者下調NIRF的表達。用Westernblotting的方法觀察HBc蛋白水平的變化。用實時熒光

4、PCR技術檢測HBV復制和分泌的情況。
　　結果
　　1.重組真核表達質粒pCMV-Myc-NIRF、pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB構建正確。
　　2.在HEK293細胞和HepG2.2.15細胞內，NIRF與HBc均存在共定位現(xiàn)象。
　　3.免疫共沉淀實驗證實，NIRF能與HBc在細胞內發(fā)生相互結合。且加入MG-132后，使得NIRF與HBc的含量升高。
　　4.NIRF在真核細胞內導致HBc降

5、解，且該降解是泛素化降解。
　　5.NIRF上調后，HBc蛋白水平降低，HBV含量下降。NIRF下調后，HBc蛋白水平升高，HBV含量上升。
　　結論
　　成功構建了真核表達質粒pCMV-Myc-MRF，pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB。無論是外源性的NIRF與HBc，還是內源性的NIRF與HBc，在細胞中均存在共定位現(xiàn)象。N1RF是HBc的一個E3 ligase。其在細胞內與HBc相互結合，導致HBc的泛素化