2011分子實驗-許雷

1、中國農(nóng)科院研究生院,2011年中國農(nóng)科院研究生院分子生物學實驗,許 雷,二零一一年六月,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,實驗內(nèi)容,,,,文庫構建技術,亞克隆技術,PCR/RT-PCR同源克隆,,基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取,RNA提取,酶切、脫磷、連接,感受態(tài)細胞制備、轉(zhuǎn)化,cDNA加街頭、磷酸化cDNA插入載體,mRNA純化cDNA一、二鏈合成,,生物大分子提取,,PCR擴增

2、RT-PCR擴增,PCR片段純化PCR片段克隆,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,實驗內(nèi)容,,,分子標記技術,原核表達和分子雜交技術,,SSH,DD-PCR,RAPDSSR,AFLP,,基因差顯技術,,探針標記Southern雜交,誘導表達SDSWestern雜交,www.themegallery.com,,7.10 質(zhì)粒DNA提?。瓑A解法 DNA的酶切技術 DNA酶切片段

3、脫磷技術7.11 基因組DNA提取 DNA片段的重組連接技術 受體菌感受態(tài)細胞的制備7.12 總RNA的提取 mRNA的提取及純化7.13 PCR/RT-PCR擴增 18sRNA片段 PCR片段回收 PCR片段克隆,7.14 cDNA文庫構建技術 - cDNA鏈合成、接頭連接 SSH - cDNA鏈的合成、酶切、接頭連接7.15 c

4、DNA文庫構建技術-磷酸化 、載體連接 SSH- 液液雜交 DD-PCR RAPD7.16 cDNA文庫構建技術-遺傳轉(zhuǎn)化 SSH-兩輪PCR擴增 SSR AFLP-酶切、連接 Southern雜交-電泳轉(zhuǎn)膜、探針標記 原核表達-誘導表達,7.17 AFLP兩輪PCR擴增 Southern雜交 -預雜交、雜交 Western雜交

5、 -電泳、轉(zhuǎn)膜7.18 Southern雜交-bloting Western雜交- bloting 測序膠電泳7.19 測序膠電泳,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,DNA提取,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,DNA提取原則,DNA結構完整 不存在對酶有抑制作用的物質(zhì) 排除有機溶劑和金屬離子的污染 蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降

6、低到最低程度 無其他核酸分子的污染,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,DNA的提取方法,染色體DNA的提取CTAB法SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結合SDS裂解法,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,基因組DNA提取,原理： 熱裂解 試劑作用 : NaCl, SDS, EDTA, Tris-H

7、Cl試驗材料： 植物葉片，菌體，菌絲等。方法步驟：A. 預處理：清洗、剪切、研磨；B.        液氮降溫，研磨；C.       裂解，高溫/低溫；D.       純化：蛋白（苯酚，酚仿，氯仿），RNA；E.  

8、;      溶解，定量（電泳/比色），檢測，保存。電 泳 0.5~0.6％ARGAROSE；比 色 50ug/ml DNA; OD260/OD280=1.8， 40 ug/ml RNA; OD260/OD280>1.8。,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,動植物材料0.5g(鮮組織)

9、 液氮,研碎 600ul裂解液/60ul酚 65℃/30min 加入等體積氯仿,輕搖混勻 離心(12000-15000rpm, 15min ) 上清液 靜止下

10、 0.6V冷異丙醇 2V無水乙醇, 0.1V乙酸鈉 0.1V乙酸鈉 室溫靜止5min -70 ℃,20min 挑取絮狀漂浮物 離心（>10000g,10min) 離心沉淀棄液體取沉淀 取沉淀 70%

11、乙醇洗滌,真空干燥, 復溶于40ul水(65 ℃),,,,,動植物基因組DNA提取,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,注意事項：1,裂解液要預熱2,各操作步驟要輕柔3,取各上清時,不應貪多4,異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預冷,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,質(zhì)粒DNA提取,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegall

12、ery.com,37℃ 200rpm搖菌過夜 1ml菌液 │ 離心 8000rpm/2min 取沉淀預冷的100ul Solution Ⅰ, 振蕩懸浮200ulSolutionII,顛倒、冰浴3-5min,150ul預冷Solution III，混勻, 冰浴5min 離心,12000rpm,,5min等體積（酚/氯仿）、氯仿抽提各一次 離心 10000g 4min,,取上清 2V的乙醇

13、/0.1V乙酸鈉 -70℃,10-20min 離心 >10000g 10min 取沉淀 70%乙醇洗沉淀 冷凍干燥 復溶于30μldd水,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,北京市清華大學附屬中學,注意,,,起始菌試劑作用,有機溶劑抽提沉淀,大質(zhì)粒和G+,嚴謹型質(zhì)粒,中國農(nóng)科院研究生院,www.t

14、hemegallery.com,RNA提取及分析鑒定 RNA提取方法 RNA提取注意事項 RNA提取鑒定及常見問題分析,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,分離提純RNA的目的 定性、定量不同發(fā)育時期基因的時空表達及其差異克隆新基因研究基因的拼接獲得生成蛋白產(chǎn)物的模板動植物轉(zhuǎn)基因檢測－Northern雜交模板構建cDNA文庫分子標記模板－cDNA-AFLP,中國農(nóng)科院研究生院,www

15、.themegallery.com,RNA的性質(zhì) 不穩(wěn)定性 核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被 RNA酶切割水解 RNA酶含量豐富，不易失活 穩(wěn)定性 剛性弱，抗機械振蕩 酸溶性好在酸性條件下溶解于水相,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,ＲＮＡ的提取過程中都有五個關鍵點：樣品細胞或組織的有效破碎有效地使核蛋白復合體變性對內(nèi)、外源ＲＮＡ酶的有效抑制有效地將ＲＮＡ

16、從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,常用RNA酶抑制劑,焦磷酸二乙酯（DEPC）： 與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑 。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。氧釩核糖核苷復合物

17、：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,提取RNA的注意事項,全部實驗過程中均需戴手套操作，所有的組

18、織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染。玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上；塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌或用氯仿浸洗，涼干。電泳槽可用0.5M NaOH或10％雙氧水浸泡2小時后，DEPC水沖洗0.1%的DEPC水溶液處理過夜,再用蒸餾水沖凈，高壓滅菌滅活；,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,試劑用DEPC處理,加入DE

19、PC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,高壓滅菌滅活；配制的溶液如不能高壓滅菌,或含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理則應用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,RNA的提取途徑：提取總核酸，再用氯化鋰沉淀出來酸性條件下抽提，酸性下DNA

20、與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA留在水相吸附柱有機溶劑沉淀,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,RNA提取的步驟,材料的裂解,雜質(zhì)的去除,RNA的吸附或沉淀,,,異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸 等。使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。,苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機相。,硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC 處理的水溶解RNA,中國農(nóng)

21、科院研究生院,www.themegallery.com,,材料準備及裂解,盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細胞及血液應盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位, 細菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。,RNA的提取,中國農(nóng)科院研究生院,ww

22、w.themegallery.com,,雜質(zhì)的抽提,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,RNA的沉淀和溶解,含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)或使用異丙醇沉淀RNA應充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時應置于－70℃ 或加入RNase抑制劑，分裝使用,RNA的提取,中國農(nóng)科院

23、研究生院,www.themegallery.com,RNA的檢測,電泳槽系統(tǒng)的處理乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測 （A260=1 ，約40 μg/ mL RNA； A260/A280 約為1.9-2.1 ）,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,1 抽提過程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染2 DNA 的污染 3 離子濃度較高,原因,對

24、策,1 保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時間的離心；增加有機溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化2 減少處理樣品的量；加入不含RNase的DNase處理；再次純化3 增加漂洗次數(shù),RNA提取常見問題,問題一： RNA樣品不純,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,1 樣品含有雜質(zhì)雜液 2 樣品過量或樣品裂解 和勻漿不徹底3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脫4 樣品RNA含量少,原因,對策,1 去除

25、樣品中的雜質(zhì)，離心除凈樣品中的培養(yǎng)基或儲存液 2 減少樣品用量；充分研磨樣品，增加裂解液的用量和裂解的時間3 延長吸附時間或保證異丙醇沉淀的時間和離心時間；再次洗脫4 重復吸附，加入肝糖等有助RNA沉淀的試劑,問題二： RNA得率低,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,操作步驟－ TRIzol試劑提取,在液氮下,研磨組織塊待液氮揮發(fā)后,將上述分散的組織約50-100mg轉(zhuǎn)移至DEPC離心管中TR

26、Izol試劑600ul,充分懸浮，室溫放置10min。0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。4 ℃ 12000rpm離心15分鐘，取上清液上層水相吸至無菌離心管中等體積氯仿抽提一次等體積異丙醇，混勻，-80℃沉淀10分鐘。4℃，12000rpm離心,10分鐘，沉淀RNA70％乙醇洗沉淀干燥復溶于DEPC水中，室溫放置。,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,ww

27、w.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,模板 樣品mRNA 1μg 引物 (0.5μg/μl)

28、 1μl （6堿基隨機引物 或oligdt） 加水至 10μl 5×第一鏈緩沖液 4μl 核酶抑制劑 1ul 40mM焦磷酸鈉 2μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1ul 加水至

29、 20μl 37°C for 1hr.2.5×第二鏈緩沖液 40μl， DNA聚合酶Ⅰ 0.5ul RNase H 0.5μl 加水至 100μl T4DNA聚合酶 1ul,中國農(nóng)科院研究生

30、院,www.themegallery.com,10×緩沖液T4DNA連接酶 1μl BSA 1μl cDNA 5μl 連接子 1μl T4DNA連接酶 1μl

31、 加水至 10μl b: 15℃保溫6-18小時,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,4X Hybridization Buffer composition: 80% formamide, 1 mM EDTA, 400 mM Na

32、Cl, 40 mM PIPES,* pH 6.7.Dilution buffer (pH 8.3) :20 mM HEPES (pH 6.6),20 mM NaCl,0.2 mM EDTA (pH 8.0) Rsa I Hind IIIcDNA synthesis primer 5'–

33、TTTTGTACAAGCTT30N1N–3',www.themegallery.com,酶切 H2O 3 μlds cDNA 5 μl10X Rsa I Restriction Buffer 1 μlRsa I (10 units/μl) 1 μl37°C，1.5 hr 抽提 沉淀連接頭

34、 Tester 1-1 Tester 1-2Component (μl) (μl)H2O 3.5 3.5T4 buffer 1 1Diluted teste

35、r cDNA 2.5 2.5Adaptor 1 (10 μM) 2 –Adaptor 2R (10 μM) – 2T4 ligase 1 1Final volume 10

36、 10 16 °C 過夜 沉淀 復溶于10 μl,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,I次雜交Component Sample 1(μl) Sample 2 (μl)Rsa I-digested driver cDNA 3 3Adaptor 1-ligated TESTER 10

37、 —Adaptor 2R-ligated TESYER — 104X Hybridization Buffer 4 4Add water to volume 20.0 20.098°C， 1.5 min；68°C ， 8 hr,（>6,

38、 <12)II次雜交Rsa I-digested driver cDNA 34X Hybridization Buffer 1 98°C， 1.5 min 加入到 Sample 1 + Sample 2 68°C 過夜,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,w

39、ww.themegallery.com,,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,TA 克隆,回收片段 8ulT4B 1ulT-vector 0.5ulT4ligase 0.5ul4 過夜,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院

40、研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,分子標記,分子標記是繼形態(tài)標記、細胞生物學標記和生化標記等后的又一種新的遺傳標記分子標記直接以基因或基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為基礎，可覆蓋整個

41、基因組或基因全體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應用于種質(zhì)鑒定、圖譜構建、基因定位、基因克隆、分子標記輔助選擇和育種等方面,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,DNA-DNA雜交為基礎的分子標記 RFLP（restriction fragment length polymorphism）標記 VNTR（重復數(shù)可變串聯(lián)重復）標記 基于PCR基礎的DNA標記隨機引物的PCR標記 RAPDISSR（inter-simple

42、 sequence repeat）引物序列參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物序列(http://www.michael- smith.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primer.pdf) AP-PCR(arbitrarity primed polymerase chain reaction)引物較長（10～50bp），引物濃度較高；引物長度不定DAF （DNA amplifi

43、cation finger printing ）引物約5－8個堿基，引物濃度比RAPD高，在多態(tài)性程度低的品種上比較有效，但穩(wěn)定性更差,www.themegallery.com,RAPDs - Random Amplified Polymophismic DNAs,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,特異引物的PCR標記 使用的引物是針對已知序列的DNA區(qū)段而設計 長度通常為18-24個

44、核苷酸 分為SSR標記、SCAR標記、STS標記、SRAP標記、RAMP標記、REMAP標記、IRAP標記、RBIP標記和PGA標記 SSR（simple sequence repeats，簡單序列重復）標記或微衛(wèi)星標記又被稱為序列標記微衛(wèi)星位點(Sequence tagged micro－satellite sites,STMS)、簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence lenth polymorphism

45、,SSLP）,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,基于PCR與限制性酶切技術結合的DNA標記 以限制性酶切和PCR技術為基礎的將兩種有機結合的DNA標記主要有兩種： 先將DNA用限制性酶進行酶切，然后再進行擴增，檢測其多態(tài)性的AFLP AFLP（Amplified Fragments Length Polymorphism）標

46、記； 先對樣品DNA進行專性化擴增，再用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切檢測其多態(tài)性的CAPS標記,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism),AFLP是由Zabeau發(fā)現(xiàn)，并由Vos建立（Vos, 1995; Zabeau和Vos, 1992）。,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院

47、研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Silver Staining,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Isotope DIG,中國農(nóng)科院研究生院,www.themega

48、llery.com,AFLP實驗程序1 模板DNA的酶切與連接,DNA（200ng/µl）1.25µlMseⅠ3單位 PstⅠ3單位MseⅠ 接頭（50 pmol/µl）1.0µlPstⅠ 接頭（5 pmol/µl） 1.0µl10×NEB Buffer2.5µl100×2.5ug/µl BS

49、A0.25µlATP（10mM） 2.0µlT4-DNA連接酶（3U/µl）0.5µl加水至25µl, 37℃酶切-連接4-6小時，或過夜。,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,2 DNA片段的預擴增,取2.0µl連接完成的DNA樣品，加入18µl如下混合液：MseⅠ 引物（M00，50ng/µl）0.6

50、1;lPstⅠ 引物（P00，50ng/µl）0.6µl10×PCR Buffer2.0µlMg2+（30mMl）1.0µlTaq酶（5U/µl，Promega，AM）0.1µldNTP（250mM）0.16µlddH2O13.54µl,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,混合后，在如下PCR條件下

51、擴增：Step195℃ 1分鐘Step295℃ 30秒Step356℃ 30秒Step472℃ 60秒Step5GOTO step2 31循環(huán),中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,3 AFLP的選擇性擴增,取4µl稀釋的預擴增混合液，加入16µl如下反應液：PstⅠ引物（50ng/µl）0.8µlMseⅠ引物（50ng

52、/µl）0.8µl10×PCR Buffer2.0µlMg2+（30mM）1.1µldNTP（25mM）0.18µlTaq酶（5U/µl）0.12µlddH2O11.0µl,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,混合后按如下PCR程序擴增： Step195℃ 2分鐘 Step295

53、℃ 30秒 Step365℃ 30秒（每循環(huán)降低0.7℃） Step472℃ 60秒 Step5GOTO step2 12循環(huán) Step695℃ 30秒 Step756℃ 30秒 Step872℃ 60秒 Step9GOTO Step6 23循環(huán),中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Core sequences for

54、 the primer sets EcoRI 5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3'MseI 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' AATTC

55、 G 接頭 EcoRI 5'-CTGCTAGACTGCGTACC-3'

56、 3'- CTGACGCATGGTTAA- 5' MseI T

57、 AAT 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3' 3'-TACTCAGGACTCAT-5',中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,www.themegallery.com,,,,,,1,,,,,,tissue,,SDS,,ProtK,,PhenolChloro,,,,,,,,ETOHSpin,,

58、,,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Structure of DIG-Modified NucleotidesCoupled via Alkali-Stable Ether Bond堿穩(wěn)定,,,,,,,,Formula: C43H61N4O21P3Li4 Molecular Weight: 1090.7,DIG-UTP (R1 = OH, R2 = OH) DIG-dUTP (R1 = OH,

59、R2 = H) DIG-ddUTP (R1 = H, R2 = H),中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Non-Radioactive Labeling of Nucleic Acids非放射性核酸標記----酶法標記,Klenow進行隨機引物標記DNA Pol I / DNase I進行缺口平移標記PCR 方法進行標記（Taq DNA Polymerase,/Pwo DNA Polymerase

60、or Expand)*寡核苷酸 3´-標記或用末端轉(zhuǎn)移酶加尾標記DNA*用SP6-, T3- or T7 RNAPolymerases*進行體外轉(zhuǎn)錄標記RNA原位標記(PRINS)用AMV/M-MuLV合成cDNAC. therm/Taq, C. therm/Pwo or C. therm/Expand進行RT-PCR,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,Non-Radioactive Ra

61、ndom Primer Labeling－隨機引物標記,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,,,,,,X-Ray Film,,,-,C,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,-,G,-,T,-,G,-,A,-,T,-,A,-,G,-,C,-,,A,-,C,-,U,-,A,-,T,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

62、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,P,,,P,,,,,,,Chemiluminescent Detection,AMPPD / CSPD / CDP-Star,Antibody-Conjugate,Labeled-Probe,Target DNA,Membrane,Digoxigenin,AlkalinePhosphatase,Substrate,Substrate,DIG Southern blotting

63、原理,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,,,,,,,,,,,,,,fragmentsize (bp),49072176176612301033653517453394298, 298234, 234220194, 194,同源Southern雜交中檢測DNA的靈敏度,,,,,,,,,,,,,,,,Nitrocellulose,,,,,,,,Nylon (uncharged membr

64、ane),fragmentsize (bp),49072176176612301033653517453394298, 298234, 234220194, 194,300,100,30,10,3,1,300,100,30,10,3,1,DNA loaded per lane (pg),DNA loaded per lane (pg),Target DNA:Dilution buffer:Probe:De

65、tection:,pBR 328 digested separately with EcoRl, Bg/l and Hinfl;50 µg/ml Herring sperm DNA 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8Digoxigenin-labeled pBR328 DNANBT/BCIP 16 hours,,中國農(nóng)科院研究生院,www.themegallery.com,中國農(nóng)科院研究生院,