北京生物公司-實驗服務(wù)-分子實驗常見問題解答

1、北京生物公司：分子實驗常見問題解答北京生物公司：分子實驗常見問題解答【嘉美生物】下面是嘉美生物總結(jié)實驗經(jīng)驗，對于分子實驗過程中常見的問題疑難解答，希望能為您帶來幫助。1、Q：提質(zhì)粒沒有明顯的沉淀，能說明是沒有提出來嗎？跑完電泳還是沒有條帶能證明質(zhì)粒沒：提質(zhì)粒沒有明顯的沉淀，能說明是沒有提出來嗎？跑完電泳還是沒有條帶能證明質(zhì)粒沒提出來嗎？提出來嗎？A：提質(zhì)粒的時候沒有明顯的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或異丙醇量不足或質(zhì)量有問題。或者

2、質(zhì)粒太少了難以用肉眼看出。跑完電泳還是沒有條帶也有可能是跑膠時配置膠出問題，或染色劑不夠，或者你加的質(zhì)粒量少。要具體情況再分析。2、Q：質(zhì)粒條帶很暗而且通常只有一條帶是什么問題？：質(zhì)粒條帶很暗而且通常只有一條帶是什么問題？A：沒有用試劑盒提取的話可能考慮技術(shù)問題。如果常做質(zhì)粒的提取，且用的是試劑盒，還出現(xiàn)這種情況，就要從質(zhì)粒本身著手考慮了：首先做個PCR鑒定一下，確保有質(zhì)粒的情況下，很可能質(zhì)粒是低拷貝的，如此就要用大量的細菌來提取質(zhì)粒。

3、一般的用可以用水煮法提(1ml菌液離心，沉淀加50μlDEPC水，100度水煮34分鐘，離心取上清夜，含有大量的質(zhì)粒)用12μl作為模板跑PCR效果很好。3、Q：用分光光度計測得的質(zhì)粒濃度很高，但是跑出來的電泳卻看不到條帶，這是什么原因？：用分光光度計測得的質(zhì)粒濃度很高，但是跑出來的電泳卻看不到條帶，這是什么原因？A：三種可能：a.可能EB有問題，應同時檢查同一塊膠上其它樣品是否有條帶。b.計算OD260280比例，有可能為蛋白污染所致

4、。c.稀釋后上樣的濃度過低。4、Q：提質(zhì)粒電泳顯示應該幾條帶？哪種情況較好？提質(zhì)粒電泳顯示應該幾條帶？哪種情況較好？A：質(zhì)粒在電泳時會出現(xiàn)三種情況的圖譜：a.三條帶，按照電泳泳動速度（快到慢）排列為：超螺旋、缺口閉環(huán)、開環(huán)。經(jīng)常會出現(xiàn)。b.兩條帶，超螺旋閉環(huán)開環(huán)任意兩種。c.一條帶，超螺旋。至于那種情況好，要看我們進一步實驗的目的了。1）進行分子克隆的操作，構(gòu)建載體。這隨便那種情況都可以，不會影響你的后續(xù)實驗。所以在這種情況下，沒必要評

5、比誰好誰不好。2）進行細胞轉(zhuǎn)染。因為轉(zhuǎn)染必須要超螺旋，所以它們的質(zhì)量好壞順序是：c、b、a。5、Q：如何降低質(zhì)粒變性超螺旋的含量？：如何降低質(zhì)粒變性超螺旋的含量？A：理論上，用堿裂解法抽提質(zhì)粒，變性超螺旋的出現(xiàn)是不可避免的。之所以大家沒有非常在意，一是因為它的存在似乎對酶反應沒有任何影響，二是因為它的含量并不一定高到被用電泳觀察到。抽提使用相對過剩的溶液，在加入溶液II后，體系能在1分鐘內(nèi)變澄清，再快速加入溶液III，這樣基本上能將變性

6、超螺旋的出現(xiàn)控制在電泳看不見的水平。(變性超螺旋電泳時比正常超螺旋跑得快一點點。)6、Q：質(zhì)粒大小如何在電泳中的鑒定？：質(zhì)粒大小如何在電泳中的鑒定？A：a.從細菌中大量提取的質(zhì)粒電泳時，不一定均出現(xiàn)三條帶，有時會出現(xiàn)兩條，甚至一條(一般是超螺旋的質(zhì)粒)，這跟上樣量也有些關(guān)系。出現(xiàn)不同的結(jié)果都是由抽提質(zhì)粒時的操作手法造13、Q：在保存或抽提：在保存或抽提DNA過程中，一般采用什么緩沖液？為什么？過程中，一般采用什么緩沖液？為什么？A：采用

7、TE緩沖液。在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用TrisHCl（pKa=8.0）的緩沖

8、系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisHTris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用TrisHCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。14、Q：如何選擇聚乙二醇（：如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀）的濃度來沉淀DNA？A：采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只

9、需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。15、Q：用酚與氯仿抽提質(zhì)粒：用酚與氯仿抽提質(zhì)粒DNA時，還要加多少量的異戊醇？時，還要加多少量的異戊醇？A：在抽提質(zhì)粒時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表

10、面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。16、Q：為了提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率：為了提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率實驗中要考慮幾個重要因素？實驗中要考慮幾個重要因素？A：a.細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培

11、養(yǎng)菌，最好從－70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，細胞密度在5107個ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率.b.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的

12、量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。c.試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。d.防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行所用器皿如離心管tip頭等最好是新的并經(jīng)高壓滅菌處理所有的試劑都要滅菌且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜