遺傳修飾動物模型在生物技術藥物安全性評價

1、遺傳修飾動物模型在藥物安全性評價中的應用,,轉基因動物的定義,相對于野生型動物而言，其基因組被遺傳修飾的動物有用遺傳修飾動物 (Genetic altered animal)一詞,轉基因動物分類,用于基礎生物學研究 -- 基因的結構和功能的關系 -- 細胞核與細胞質的相互作用 -- 胚胎發(fā)育和調控等生命科學中的基本問題用于育種改良 --提高動物的生長速度

2、 --改善肉質營養(yǎng) --增強抵抗疾病的能力用于生產目的蛋白、生物反應器 -- tPA，凝血因子用于各種疾病動物模型 --癌癥轉基因動物模型 --免疫缺陷動物模型等,轉基因動物模型安全性評價優(yōu)勢,對受試物的敏感性增加。 --如帶有激活Pim-l腫瘤基因的轉基因動物，對乙基硝基脲的致癌作用，較相應的非轉基因動物，其敏感性提高了25倍。轉基因動

3、物模型用于安全評價，節(jié)省時間，縮短實驗進程，減少動物的用量，符合3R原則 --傳統(tǒng)的致癌性實驗采用普通大小鼠，實驗長達2年，時間長，需要的動物數(shù)量大，采用轉基因動物模型，可以在6個月內得知結果，顯著節(jié)省時間 --采用TgPVR21轉基因小鼠替代猴進行神經(jīng)毒性測試，測試效果與猴一致,國際獲得廣泛認可的癌癥動物模型,TG:ACrasH2p53+/-XPA-/-TG:AC，p53+/-和rasH2

4、模型在美國或日本已實現(xiàn)商品化，并獲得ICH等國際機構的認可,TG:AC小鼠模型的建立和生物學特性,人類正常的ras基因家族包括c-Ha-ras，c-Ki-ras和c-N-ras三個成員，其中c-Ha-ras位于11號染色體上ras基因編碼細胞增殖信號傳導途徑中的一個189個氨基酸的關鍵蛋白分子P21蛋白，是生長因子受體與下游分子聯(lián)系的必經(jīng)之路，其活性可以通過與GTP－GDP的交換來調節(jié)P21蛋白在細胞分化和抑制細胞凋亡中扮演很重要的

5、作用ras基因在第12、13、59、61位氨基酸發(fā)生突變時，其編碼的蛋白活性增高，易誘導癌變,TG:AC小鼠模型的建立和生物學特性,該模型是通過顯微注射的方法獲得的受精卵來自近交系FVB小鼠轉基因表達的部位包括胚胎期的血液、肝和胎盤。此外在成年小鼠的骨髓中也有低水平的表達用佛波酯 (Phorbol ester)處理轉基因鼠，6個星期內能誘導產生多種乳頭瘤，部分小鼠發(fā)生鱗狀細胞瘤，多數(shù)情況下產生惡性肉瘤,RasH2轉基因鼠模型的建

6、立及生物學特性（一）,轉入該模型的DNA為人的正常ras基因 (c-Ha-ras)，全長大小為6.8 Kb轉化型ras基因最初是從日本病人惡性黑色素瘤組織中獲得的，被保留在裸鼠NIH 3T3成纖維細胞中擴增,RasH2轉基因鼠模型的建立及生物學特性（二）,該模型十分穩(wěn)定，從未出現(xiàn)過應答消失特別適合對食道癌研究rasH2轉基因模型誘發(fā)腫瘤的器官主要限于肺、皮膚和前胃2000年又建立了c-Ha-ras轉基因大鼠模型，命名為Hras1

7、28。該大鼠轉基因模型不僅可用于篩選致癌物和癌癥誘導因子，還可用于篩選抑制癌癥的藥物,c-Ha-ras轉基因小鼠的檢測,標記基因斑點雜交和PCR擴增Southern雜交Northern雜交表達產物檢測,p53+/-小鼠模型的建立及生物學特性,p53蛋白首先發(fā)現(xiàn)于SV40病毒轉化的嚙齒類動物細胞C57BL/6轉基因小鼠模型在6個月時易自發(fā)產生多種腫瘤，但胚胎發(fā)育正常這一模型從整體動物水平證實了p53基因與胚胎發(fā)育無直接相關性，

8、但它的缺失使動物易發(fā)生腫瘤類疾病,XPA-/-小鼠模型的建立及生物學特性,著色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum, XP)是一種常染色體隱性遺傳病，受到日照后易發(fā)生皮膚癌和神經(jīng)綜合癥該模型是在NER基因成功克隆的基礎上，以干細胞為基礎，通過基因敲出的方式構建的該模型不僅僅對紫外線敏感，而且對一些致癌性化學物也非常敏感，能誘導產生多種內臟腫瘤,轉基因動物用于評價需要注意的問題,必須有完全的病理學檢查需要非轉基因小

9、鼠或者野生型小鼠作為對照需要檢測轉入基因是否穩(wěn)定等實驗周期可能超過6個月，也需要更多的實驗動物,國際上轉基因動物應用的指導原則,1995年FDA “生產和檢驗源于轉基因動物的人用生物制品的指導原則”(Points to Consider in the Manufacture and Testing of Therapeutic Products for Human Use Derived from Transgenic Animal

10、s)。該指導原則規(guī)定了首建動物的創(chuàng)建和繁殖、轉基因動物及其后代的飼養(yǎng)與維護等基本準則歐盟EMEA (European Medicine Evaluation Agency)通過其下屬機構CPMP (Committee for Proprietary Medical Products)制定了內容相似的指導原則。ICH在著手修訂相應的指導原則，以促進轉基因動物模型在致癌性實驗中的應用,FDA制定的指導原則,轉基因動物的定義轉基因動物的

11、飼養(yǎng)轉基因動物的維持轉基因動物的使用使用后的轉基因動物的處置,轉基因動物的定義,通過導入重組DNA的方法制作的人為修飾動物，包括兩類：一種為可遺傳的修飾，一種為體細胞非遺傳修飾第一類轉基因動物包括通過對配子、早期胚胎或者胚性干細胞系的體外操作獲得可通過生殖細胞遺傳的動物第二類包括通過質粒注射、病毒介導的基因轉移等基因治療手段獲得的體細胞改變的動物轉基因 (Transgene) 指的是一段導入體細胞的或者穩(wěn)定整合在宿主基因組中

12、并能穩(wěn)定遺傳給下一代的重組DNA,首建轉基因動物的建立及性質分析,配子或者胚性細胞供體動物及代孕動物的來源及歷史必須明確轉基因的方法需清楚必須寫明首建轉基因動物的鑒定方法，建立轉基因鑒定的靈敏度檢測標準，區(qū)分轉入外源基因但不表達目標產物的動物與未進行轉基因操作的動物當將轉基因動物作為食品供人食用時，必須符合FDA (CVM或CFSAN)或者FSIS的管理規(guī)定一旦建立了首建轉基因動物，轉基因的穩(wěn)定性必須持續(xù)監(jiān)測,建立持續(xù)可靠的轉基

13、因動物源 (首建轉基因動物系),轉基因動物應建立主轉基因動物庫 (Master transgenic bank, MTB)工作轉基因動物庫 (Manufactures working transgenic bank，MWTB),轉基因動物的生產與選擇,應該建立標準 ----歷史來源，每一只轉基因動物能溯源到它的首建轉基因動物 ----產地、出生日期、用途、疾病發(fā)生時間及處置方法詳細記錄轉基因動物的育種

14、方法 ----任何人工受精、胚胎移植、精子采集與存儲方法以及所采用的標準建立生產轉基因動物的質量標準,轉基因動物的維持,疾病監(jiān)控圈養(yǎng)設施生產群中轉基因動物的淘汰與處置哨兵動物的設置,轉基因生物制品的純化及特性,與傳統(tǒng)的源于哺乳動物細胞或者大腸桿菌表達系統(tǒng)的生物制品的要求類似對轉基因動物可能含有對人體不利的病原物，如病毒、細菌、支原體確立合適的檢測和分析方法，以確保產品的安全來自不同的動物或者同一動物的不同組織的