基因診斷與基因治療

1、基 因 診 斷 與基 因 治 療,基因診斷的概念,基因是遺傳學(xué)上的一個(gè)概念，是在染色體上占有一定的位置，表現(xiàn)一定功能的基本單位基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是脫氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA）基因診斷是指運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法檢查基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)產(chǎn)物，是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。,基因診斷的分子生物學(xué)基礎(chǔ),基因診斷操作的對(duì)象為基因或其片段運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，檢查特定基因的存在與否、基

2、因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能是否正常等，從而確定：是否患有某種遺傳病：成年人遺傳型分析，產(chǎn)前診斷是否患有某些特定的微生物感染疾病是否患有某種腫瘤，對(duì)腫瘤病人的預(yù)后進(jìn)行分析基因配型，用于移植、輸血等法醫(yī)學(xué)上，分析犯罪現(xiàn)場(chǎng)的證實(shí)與嫌犯的鑒別,基因診斷的途徑,檢查是否存在特定的DNA或RNA，用于微生物感染的診斷基因突變的檢測(cè)限制性內(nèi)切酶酶譜分析等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法基因連鎖分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)基因

3、的單堿基多態(tài)性分析(SNP)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA檢測(cè)基因型的鑒定與比較,基因診斷的對(duì)象,1、病原生物的侵入：一般侵入體內(nèi)的病原生物可通過(guò)顯微鏡檢查各免疫學(xué)方法進(jìn)行診斷。直接檢測(cè)病原生物的遺傳物質(zhì)提高診斷的敏感性2、先天遺傳性疾患：已有多種傳統(tǒng)的遺傳性疾患的發(fā)病原因被確定為特定基因的突變。例如：苯丙氨酸羥化酶基因突變可引起苯丙酮尿癥：腺苷脫胺酶基因突變可引起重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID)；而淋巴細(xì)胞表面分子CD40或其配體（CD40

4、L）基因突變則可引起無(wú)丙種球蛋白血癥。用基因診斷的方法檢測(cè)其基因突變利于確診和治療方案的建立3、后天基因突變引起的疾病：腫瘤。腫瘤的發(fā)生是由于個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無(wú)限增殖?；蛟\斷可確定抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變4、其它：如DNA指紋、個(gè)體識(shí)別，親子關(guān)系識(shí)別，法醫(yī)物證等,基因診斷的運(yùn)用,一是通過(guò)檢測(cè)特定基因或相關(guān)疾病基因的存在以判斷和評(píng)估某疾病在某一個(gè)體上發(fā)生某疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以導(dǎo)向預(yù)防這種疾病的發(fā)生二是通過(guò)基因診斷促

5、使個(gè)性化藥物的誕生三是通過(guò)基因診斷更精確判斷某些傳染性疾病或腫瘤等疾病的存在，以有利于臨床醫(yī)生盡早確定病因基因診斷技術(shù)不僅在疾病檢測(cè)上具有重要意義，而且在婚前檢查，親子鑒定等人類生活方面具備廣闊運(yùn)用前景,基因診斷的方法,PCR核酸雜交基因芯片(chip)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amp-FLP) 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法(ASO) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法 (SSCP),PCR技術(shù)的發(fā)明及特點(diǎn),1985年Saiki 首次用以

6、擴(kuò)增β珠蛋白基因標(biāo)志PCR技術(shù)的問(wèn)世。PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、特異和靈敏等特點(diǎn)，它用于基因診斷，使之發(fā)生了革命性的變化。PCR技術(shù)可使待測(cè)樣品中的目的基因片段在幾小時(shí)內(nèi)，甚至十幾秒內(nèi)擴(kuò)增百萬(wàn)倍，如果標(biāo)本中原來(lái)的目的基因達(dá)到fg級(jí)水平，就可以通過(guò)簡(jiǎn)單電泳和溴化乙啶(EB)顯示擴(kuò)增后的核酸片段區(qū)帶。從檢測(cè)區(qū)帶的電泳位置看它是否符合引物設(shè)計(jì)的擴(kuò)增長(zhǎng)度。,PCR技術(shù)的進(jìn)展,PCR-Southern印跡 模板檢測(cè)靈敏度可

7、達(dá)ag級(jí)水平(可查出幾個(gè)病毒的存在)則能看到雜交帶。特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，但操作費(fèi)時(shí)間，一次需3d，這使急于根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定治療措施的臨床醫(yī)生迫不及待。套式PCR 是指在用第一對(duì)引物(外引物)擴(kuò)增之后，加入另一對(duì)位于外引物內(nèi)側(cè)的內(nèi)引物，再行擴(kuò)增數(shù)十個(gè)循環(huán)，這可將標(biāo)志檢測(cè)時(shí)間壓縮8-10h，第2日便可獲得高敏感性的檢查結(jié)果。其敏感性大致與PCR-Southern印跡相當(dāng)。,PCR的微量化 反應(yīng)體積減少至10

8、-20μl，降低了PCR檢測(cè)的成本。在1次PCR中加入多對(duì)引物，可用于病毒、細(xì)菌等的分型和多種病原體基因的檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用專為檢測(cè)雙鏈DNA而設(shè)計(jì)的微量熒光計(jì)定量，就可從標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的量或拷貝數(shù)達(dá)到PCR定量的目的。取樣技術(shù)的改進(jìn) 對(duì)于產(chǎn)前診斷，初期是取羊水細(xì)胞，需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。從1982年起采取妊娠8-12周的絨毛DNA作產(chǎn)前診斷使產(chǎn)前基因診斷的時(shí)間提前。由于PCR技術(shù)的應(yīng)用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可作

9、產(chǎn)前診斷。,反向遺傳學(xué)策略 過(guò)去尋找致病基因是從經(jīng)典遺傳學(xué)思路出發(fā)，先發(fā)現(xiàn)疾病的表現(xiàn)改變，再經(jīng)過(guò)不同方法由表型追溯到基因。近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的“反向遺傳學(xué)”(reverse genetics)在策略上解決了經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解決的這個(gè)難題。在不知道和不必知道基因產(chǎn)物或表型的情況下分離和定位致病基因，并由它的一級(jí)結(jié)構(gòu)推出產(chǎn)物的氨基酸序列。方法：須先采用細(xì)胞遺傳學(xué)方式或RFLP連鎖分析確定致病基因在染色體上的大概位置，然后采用染色體步移（

10、chromosome walking）或染色體跳躍（chromosome hopping）技術(shù)逐漸接近，最后找到的基因的準(zhǔn)確位置。成功例子：如Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良和囊性纖維變等致病基因的發(fā)現(xiàn)；預(yù)計(jì)亨廷頓舞蹈病、神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性腸息肉和成人型多囊腎等疾病的致病基因，不久可望用此策略得以確定。,核酸雜交概念,不同來(lái)源的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補(bǔ)，就可以經(jīng)退火處理復(fù)性現(xiàn)象，形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)

11、，這種依據(jù)相應(yīng)堿基配對(duì)而使不完全互補(bǔ)的兩條鏈相互結(jié)合稱為分子雜交。,核酸雜交分類,基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類DNA探針還有單鏈和雙鏈之分,核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè),核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)缺口平移DNA快速末端標(biāo)記用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNA 5‘末端，隨引物延伸聚合酶鏈反應(yīng)核酸探針的非放射性

12、標(biāo)記技術(shù)光促生物素標(biāo)記核酸酶促生物素標(biāo)記核酸寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記酶標(biāo)DNA酶標(biāo)寡核苷酸DNA半抗原標(biāo)記,核酸分子雜交方法,核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。,基因芯片概念,也叫DNA芯片，是在90年代中期發(fā)

13、展出來(lái)的高科技產(chǎn)物?；蛐酒笮∪缰讣咨w一般，其基質(zhì)一般是經(jīng)過(guò)處理后的玻璃片。每個(gè)芯片的基面上都可劃分出數(shù)萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)個(gè)小區(qū)。在指定的小區(qū)內(nèi)，可固定大量具有特定功能、長(zhǎng)約20個(gè)堿基序列的分子探針。,基因芯片的原理及用途,原理：由于被固定的分子探針在基質(zhì)上形成不同的探針陣列，利用分子雜交及平行處理原理，基因芯片可對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)可用于進(jìn)行基因研究、法醫(yī)鑒定、疾病檢測(cè)和藥物篩選等特點(diǎn)：基因芯片技術(shù)具有無(wú)可比擬的高效、快速和多參量特點(diǎn)

14、，是在傳統(tǒng)的生物技術(shù)如檢測(cè)、雜交、分型和DNA測(cè)序技術(shù)等方面的一次重大創(chuàng)新和飛躍,基因芯片應(yīng)用,基因破譯 ：基因功能；提高測(cè)序速度基因診斷 ：癌癥、糖尿病等，借助一小滴測(cè)試液，醫(yī)生們能預(yù)測(cè)藥物對(duì)病人的功效，可診斷出藥物在治療過(guò)程中的不良反應(yīng)，還能當(dāng)場(chǎng)鑒別出病人受到了何種細(xì)菌、病毒或其他微生物的感染。,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性,概念：小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長(zhǎng)度多態(tài)性可以通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱

15、為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）連鎖分析法。方法：PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時(shí)只有幾個(gè)核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。,等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法,當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide, A

16、SO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長(zhǎng)20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)一般需要合成兩種探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正常基因序列穩(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開(kāi)來(lái)。PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大

17、大簡(jiǎn)化了方法，節(jié)約了時(shí)間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。,單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法,單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或突變的檢測(cè)。用SSCP法檢查基因突變時(shí)，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR

18、擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)此作出診斷。PCR－SSCP法具有能快速、靈敏地檢測(cè)有無(wú)點(diǎn)突變或多態(tài)性的優(yōu)點(diǎn)，但如欲闡明突變的堿基性質(zhì)，則需作序列分析。,基因診斷的質(zhì)量控制,特異性：雜交技術(shù)是通過(guò)基因克隆制備探針來(lái)完成，PCR是通過(guò)引物來(lái)完成，RFLP是利用限制內(nèi)切酶來(lái)完成等。即探針、引物、限制性內(nèi)切酶在反應(yīng)中都具有特異性。靈敏度：雜交技術(shù)用同位

19、素或酶標(biāo)記探針，PCR反復(fù)擴(kuò)增20-30次都是提高靈敏度的手段。二次PCR、PCR與Southern blot合用都是典型的例子。操作簡(jiǎn)單：雜交技術(shù)因操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)（需1-2天以上出結(jié)果），在臨床實(shí)驗(yàn)室難以推廣。而PCR方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，故推廣迅速。實(shí)驗(yàn)成本：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)因試劑多數(shù)依賴進(jìn)口，成本高，給臨床推廣造成一定困難。試劑國(guó)產(chǎn)化是今后的努力方向。重復(fù)性和穩(wěn)定性,基因診斷的應(yīng)用,感染性疾病病毒性疾病的診斷：HBV、HCV、

20、HIV和HPV細(xì)菌性疾病的診斷：TB、瘧原蟲(chóng)遺傳性疾病鐮刀狀細(xì)胞貧血癥：beta-珠蛋白基因AT變換甲型血友?。耗蜃覸III腫瘤 ras癌基因突變、c-myc癌基因 p53抑癌基因、p16抑癌基因產(chǎn)前診斷、移植配型法醫(yī)鑒定,基因診斷的意義,一是可以解決遺傳性疾病難以診斷的黑洞，由于遺傳性疾病主要是由特定的DNA序列即基因決定的，通過(guò)基因診斷能夠在遺傳病患者還未發(fā)現(xiàn)出任何癥狀之前就能確診二是肝炎、癌癥、艾滋病都與病

21、毒有關(guān)，而通過(guò)基因診斷技術(shù)就可以順利檢查出隱藏在人體細(xì)胞基因中的病毒從而在造成危害之前消滅它們。,基因治療 (Gene Therapy)的概念,人類疾病的發(fā)生，是人體細(xì)胞中自身基因的改變，是由外源病原體的基因產(chǎn)物與人體基因相互作用的結(jié)果。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家設(shè)想人類能否最終運(yùn)用遺傳物質(zhì)，無(wú)論是人類自身的或是外源遺傳物質(zhì)來(lái)治療疾病，糾正人體本身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，阻止病菌的 ，殺滅病變的細(xì)胞或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，保證人體健

22、康?；蛑委?gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因較正或置換致病基因的一種治療方法。目的基因被導(dǎo)入到靶細(xì)胞（target cells）內(nèi)，他們或與宿主細(xì)胞（host cell）染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細(xì)胞中得到表達(dá)，起到治療疾病的作用。目前基因治療的概念有了較大的擴(kuò)展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開(kāi)展的疾病治療方法都可稱為基因治

23、療。隨著對(duì)疾病本質(zhì)的深入了解和新的分子生物學(xué)方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的發(fā)展。,基因治療的潛力,基因治療的歷史沿革 1990年，科學(xué)家第一次用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把腺苷脫氨酶基因（ADA）導(dǎo)入來(lái)自病人自身的T淋巴細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增后輸回患者體內(nèi)，獲得可成功。標(biāo)志著基因治療時(shí)代的開(kāi)始。 1995年美國(guó)FDA批準(zhǔn)Ad－P53腫瘤基因治療等臨床試驗(yàn)的實(shí)施，標(biāo)志著基因治療已逐步進(jìn)入一個(gè)正常的、目標(biāo)明確的理性化發(fā)展階段。,18歲

24、的格爾辛基（Jesse Gelsinger）因臨床試驗(yàn)的某些失誤而于1999年9月17日死亡。格爾辛基是世界上首位由基因治療導(dǎo)致喪生的患者。他患先天性鳥(niǎo)氨酸甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥（X連鎖性遺傳?。┎“Y，在男性身上較嚴(yán)重，往往引起新生男嬰患者的死亡。2006年7月24日,來(lái)自伊利諾斯州的一名36歲女患者，為了治療自己的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎而采用基因治療的方法,在一條腿的膝蓋部位注射了藥劑結(jié)果死亡,該公司也被迫關(guān)閉。,基因治療的前景分析

25、基因治療是將具有治療價(jià)值的基因，即“治療基因”裝配于帶有在人體細(xì)胞中表達(dá)所必備元件的載體中，導(dǎo)入人體細(xì)胞，直接進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)行基因治療時(shí)毋須對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，因?yàn)槿思?xì)胞本身可以完成這個(gè)過(guò)程。,可大大降低治療成本。因?yàn)榛蛑委煵恍枰蚬こ讨泻馁Y最大的器材與材料費(fèi)用，顯著降低了工業(yè)化的成本。基因工程的“目的基因” 往往不能有效地進(jìn)入細(xì)胞而不能備應(yīng)用于基因工程。但基因治療不受上述限制。具有治療作用，理論上均可應(yīng)用于基因治療。因此

26、，基因治療具有更大的潛力。,基因治療則必須將基因直接導(dǎo)入人體細(xì)胞，不僅在技術(shù)上具有很大難度，而且在有效性于安全性方面提出了風(fēng)為苛刻的要求?；蛑委焹H有10年的歷史，不少技術(shù)還不夠成熟。所以，它所遇到的風(fēng)險(xiǎn)性更大。,基因治療的策略,基因置換（gene replacement）：基因置換就是用正常的基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)原因尚難達(dá)到。基因修復(fù)（gene

27、 correction）：基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復(fù)，操作上要求高，實(shí)踐中有一定難度。,基因修飾（gene augmentation）又稱基因增補(bǔ)，將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能修飾缺陷細(xì)胞的功能或使原有的某些功能得以加強(qiáng)。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙?/p>

28、內(nèi)皮細(xì)胞并得以表達(dá)后，防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)誘發(fā)的血檢形成基因失活（gene inactivation）：利用反義技術(shù)能特異地封閉基因表達(dá)特性，抑制一些有害基因的表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。用此技術(shù)還可封閉腫瘤細(xì)胞的耐藥基因的表達(dá)，增加化療效果。,免疫調(diào)節(jié)（immune adjustment）：將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)爰踩梭w內(nèi)，改變

29、病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如將白細(xì)胞介素-2導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達(dá)到防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。其它：增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害。如向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予病人無(wú)毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細(xì)胞才能將CGV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因而腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。耐藥基因治

30、療：將產(chǎn)生抗藥物毒性基因如MDR-1導(dǎo)入干細(xì)胞中，使機(jī)體耐受更大劑量的化療或放療,遺傳性疾病基因治療策略,隱性遺傳病 用正?；蛑脫Q致病基因而達(dá)到完全校正導(dǎo)入正?；蛐蛄幸赃_(dá)到暫時(shí)性校正顯性遺傳病用正?；蛑脫Q致病基因而達(dá)到完全校正使有害基因失活而達(dá)到暫時(shí)性校正（如用反義技術(shù)、核酶等）在某些情況下可導(dǎo)入正?；蚣右孕Ｕㄈ鏛DL受體）,低密度脂蛋白受體,疾病基因治療策略,腫瘤殺傷腫瘤細(xì)胞：利用自殺基因，激活免疫系統(tǒng)及保護(hù)正

31、常細(xì)胞免受化療藥物的損傷等使癌基因失活（反義技術(shù)、核酶）增加抑癌基因的表達(dá)傳染病殺傷傳染源（免疫法、自殺基因） 使傳染源失活（反義技術(shù)、核酶、核酸陷井）其它疾病導(dǎo)入藥物基因（藥物釋放）如激素、細(xì)胞因子失活、有害基因產(chǎn)物（反義技術(shù)、核酶、核酸陷阱）殺傷策略如減少特異細(xì)胞群,體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy)的途徑Ex vivo – cells removed from body, inc

32、ubated with vector and gene-engineered cells returned to body.In situ – vector is placed directly into the affected tissues.In vivo – vector injected directly into the blood stream.,咨詢,體細(xì)胞,半乳糖血癥,飲食的,苯丙酮尿癥,抗瘧疾藥物,甲狀腺素,甲狀

33、腺低能癥,苯甲酸酯,降膽固醇藥,吡哆醇,高胱氨酸尿,脫氨酶,戈謝病,葡萄糖腦苷脂病,炎癥或肉芽腫性,地中海貧血,基因治療的障礙1. 基因治療載體的建立2. 治療基因的構(gòu)建3. 受體細(xì)胞的增殖與維持有效的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使DNA進(jìn)入受體細(xì)胞核內(nèi)并整合到染色體基因組中4. 經(jīng)基因轉(zhuǎn)移后的治療用細(xì)胞的增殖和向病人的移植,治療基因在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn),實(shí)驗(yàn)室基因治療研究,疾病的遺傳背景及機(jī)制的揭示可選治療基因的篩選及評(píng)價(jià)基因治療藥物的制備治

34、療用目的基因基因轉(zhuǎn)移及表達(dá)載體接受基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的方法途徑的選擇基因治療效果的評(píng)估基因治療藥物的安全性評(píng)估,臨床人體基因治療的基本程序,疾病的評(píng)估目的基因的選擇和制備基因的轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因治療藥物的制備受體靶細(xì)胞的選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)染(transfection)或感染(Infection)外源基因的表達(dá)及檢測(cè)基因治療的療效評(píng)價(jià)基因治療的安全性及倫理學(xué),基因治療所應(yīng)用的治療基因,基因治療的載體系統(tǒng),RNA病毒載體(反

35、轉(zhuǎn)錄病毒)RNA viruses (Retroviruses)1. 鼠白血病病毒 Murine leukemia virus (MuLV)2. 人免疫缺陷病毒 Human immunodeficiency viruses (HIV)3. 人T淋巴細(xì)胞病毒 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) 4. 慢病毒 Lentinovirus,DNA病毒載體 DNA virus

36、es1. 腺病毒Adenoviruses2. 腺相關(guān)病毒Adeno-associated viruses (AAV)3. 單純胞疹病毒Herpes simplex virus (HSV)4. 痘病毒Pox viruses5. 濾泡病毒Foamy viruses,非病毒載體Non-viral vectors1. 脂質(zhì)體Liposomes2. 裸DNA Naked DNA3. 脂質(zhì)體-聚陽(yáng)離子復(fù)合物L(fēng)ip

37、osome-polycation complexes4. 多肽傳遞系統(tǒng)Peptide delivery systems,病毒載體的類型,重組型病毒載體(Recombinant virus vectors)以完整的病毒基因組為改造對(duì)象。一般的步驟是選擇性地刪除病毒的某些必需基因尤其是早期基因，或控制其表達(dá)；缺失的必需基因的功能由互補(bǔ)細(xì)胞反式提供；用外源基因表達(dá)單位替代病毒非必需基因區(qū)；病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件不變。通過(guò)同源

38、重組方法將外源基因表達(dá)單位插入病毒基因組中。如在傳統(tǒng)的重組腺病毒構(gòu)建方法中，將外源基因表達(dá)盒（Exogenous gene expression cassette）插入穿梭質(zhì)粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，與輔助質(zhì)粒（含有腺病毒基因組的質(zhì)粒如JM17或pBHG）共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的同源重組獲得含有外源基因的重組腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。,無(wú)病毒基因的病毒載體（Gutl

39、ess vectors）在不同的病毒載體系統(tǒng)中的稱謂不同。對(duì)于腺病毒，一般稱為mini-Ad；在HSV載體系統(tǒng)，一般稱為擴(kuò)增子（Amplicon）載體或質(zhì)粒型載體。重組AAV載體也屬于無(wú)病毒基因的病毒載體。由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。重組載體質(zhì)粒主要由外源基因表達(dá)盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件。在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體質(zhì)粒（包含或不包含質(zhì)粒骨架）以特定形

40、式（單鏈或雙鏈，DNA或RNA）被包裝到病毒殼粒中，其中不含有任何病毒基因。優(yōu)點(diǎn)在于載體病毒本身安全性好，容量大。缺點(diǎn)在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，而輔助病毒又難以同載體病毒分離開(kāi)來(lái)，造成最終產(chǎn)品中輔助病毒污染，從而影響其應(yīng)用。,基因治療臨床試驗(yàn)采用的載體系統(tǒng),病毒載體的順式作用元件和經(jīng)典包裝方式,常用病毒載體的特性和適用范圍,Advantages:Randomly integrates into genomeWide

41、 host rangeLong term expression of transgeneDisadvantages:Capacity to carry therapeutic genes is smallInfectivity limited to dividing cellsInactivated by complement cascadeSafety,Life cycle of a retrovirus,Gene the

42、rapy constructs maintained at this stage.,,Adenovirus,Advantages:Efficiency of transduction is highHigh level gene expressionSlightly increased capacity for exogenous DNADisadvantages:Expression may be transientCel

43、l-specific targeting difficult to achieveVirus uptake is ubiquitousSafety,Other viral vectors,Adeno-associated virus – infects wide range of cells (both dividing and non-dividing), able to integrate into host genome, n

44、ot associated with any human disease, high efficiency of transduction.Herpes simplex virus, vaccinia virus, syndbis virus, foamy viruses – not yet widely studiedOnyx virus – limited replicating adenovirus that replicat

45、es mainly in tumor cells.,1. Liposome,2. Cationic polymers,Non-viral vectors,May overcome limitations with viruses including small capacity for therapeutic DNA, difficulty in cell-type targeting and safety concerns.,4.

46、 Peptide-mediated gene delivery,3. Naked DNA,Steps in synthesis of a therapeutic gene therapy gene construct,Arrangement of native retrovirus genome,,Synthesis of a retroviral gene therapy vector,,Site of insertion of

47、therapeutic gene,基因轉(zhuǎn)移方法系統(tǒng),基因轉(zhuǎn)移的篩選系統(tǒng),陽(yáng)性選擇系統(tǒng)隱性基因互補(bǔ)作用基因胸腺嘧啶激酶基因(thymidine kinase gene, tk) 二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolic reductase gene, dhft) 次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移基因(hypoxanthine guanine phoshporibosyl-transferase gene, hgpt)氨基甲酰磷

48、酸合成酶－天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶－二氫乳清酸酶(CAD) 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(GDC),顯性抗性基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin phoshpotransferase gene, neo) 黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(xanthine guanine phosphoribosyl-transferase gene, xgprt) 腺嘌呤核苷脫氨酶(adenosine deaminase, ada) 天冬酰胺合成酶(a

49、sparagines synthetase gene, as) 多藥物抗性基因(human multidrug resistance gene, mdrⅠ),濕霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin resistant gene, hph) 突變的二氫葉酸還原酶(mDHFR)金屬硫蛋白基因(MT) 腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(adenine phosphoribosyl-transferase gene, aprt) 色氨酸

50、合成酶基因(trytophane synthase gene) 組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene, hisD) 烏本苷抗性基因(ouabain resistant gene, ouar),陰性選擇系統(tǒng)在負(fù)性選擇系統(tǒng)中，攜帶某個(gè)活性基因的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中被殺死，而不帶有該基因，或該基因因?yàn)楦鞣N原因被滅活的細(xì)胞則存活下來(lái)，其作用機(jī)理是某基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性或者能將培養(yǎng)液中的一些成分轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)

51、細(xì)胞有毒性的物質(zhì)。有時(shí)此類基因也稱為“自殺性基因”，被用于腫瘤的基因治療中。胞嘧啶脫氨酶基因(cytosine deaminase gene, CD) 胸苷激酶基因(thymidine kinase gene, tk ) 白喉毒素A鏈基因(diphtheria toxin A chain gene, DT-A),轉(zhuǎn)移基因的表達(dá),治療基因的表達(dá)水平治療基因的持續(xù)時(shí)間治療基因的可調(diào)控表達(dá)治療基因的組織特異性表達(dá)基因表達(dá)的檢測(cè),

52、基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng),靶向基因治療,基因治療的理想：修復(fù)突變基因，恢復(fù)正常的基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制現(xiàn)行基因治療：附加基因或其表達(dá)產(chǎn)物的治療，故又稱基因替代療法靶向基因治療的意義：選擇性針對(duì)患病組織細(xì)胞選擇性針對(duì)突變基因：突變基因的原位修復(fù)減少不必要的副作用，提高安全性,轉(zhuǎn)移基因的同源重組,轉(zhuǎn)移DNA 細(xì)胞核 染色體整合 附加體形式隨機(jī)整合(常見(jiàn))

53、 同源重組(稀有),,,,,,基因修復(fù)：鑒定并修復(fù)錯(cuò)誤基因,基因靶向治療的策略,逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向基因轉(zhuǎn)移,一、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型的選擇調(diào)節(jié)1、改變Mo-HLV感染譜 按宿主范圍可將Mo-HLV分為三類：?jiǎn)蜗蛐裕褐荒芨腥緡X類細(xì)胞；異向性：可感染除嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞以外的其它的細(xì)胞；雙向性：可感染人及嚙齒類動(dòng)物等大多數(shù)細(xì)胞。感染細(xì)胞的類型是由病毒的外殼蛋白env確定的。（1）病毒與抗體的偶聯(lián)：為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒定向感染

54、所需要的靶細(xì)胞，可將病毒與抗體偶聯(lián)，該抗體則針對(duì)所需感染細(xì)胞上特有的抗原。如使單向感染病毒與抗人MHC-1。MHC-II的抗體偶聯(lián)或與抗人表皮生長(zhǎng)因子的抗體偶聯(lián)后，可以感染人類細(xì)胞。Goud等使用此法使單向病毒感染人的肝細(xì)胞，可惜病毒未能整合入肝細(xì)胞基因組，可能其中還有其它原因。,（2）病毒外殼蛋白與配體偶聯(lián)：  如將env蛋白與乳糖偶聯(lián)成去延酸糖蛋白，用此法改造的單向逆轉(zhuǎn)錄病毒將不再感染原先的宿主而只感染人的肝細(xì)胞，因?yàn)橹挥?/p>

55、肝細(xì)胞表面上含有去延酸糖蛋白的受體。 （3）改變病毒外殼蛋白的識(shí)別序列：已發(fā)現(xiàn)env蛋白與被感染細(xì)胞受體相識(shí)別部位的化學(xué)組成，如果改變核表位的基因序列，就可能改變感染細(xì)胞的類型，但Etienne等認(rèn)為有一個(gè)潛在的、非病毒原有的表位與細(xì)胞受體識(shí)別之后不能使病毒內(nèi)化。一種可行的方法是同時(shí)表達(dá)原有的env蛋白，就能解決內(nèi)化問(wèn)題。,2、使用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體： 牛白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺腫瘤病毒有組織專一性感染的特點(diǎn)

56、，有些研究組利用其作為載體。Page等采用HIV作為病毒載體，Rizvi等用BLV作載體，Morris等采用MMTV作載體，并構(gòu)建了MMTV獨(dú)特的包裝細(xì)胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。,3、以嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染譜是由病毒顆粒決定的，改變病毒顆粒蛋白，即env基因改變感染宿主范圍。Laudau等用鳥(niǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因，Miller

57、等用長(zhǎng)臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多種細(xì)胞，并取得較高的滴度Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，將血凝素成功地嵌入病毒外殼，并能有效感染人和鳥(niǎo)類細(xì)胞Jane等用泡狀口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使該病毒顆粒能成功地感染非哺乳動(dòng)物如Zebra fish細(xì)胞，更重要的是這種病毒外殼可耐受超離心而不影響感染效率，因此有利于濃縮病毒，提高滴度。,目的基因組織專一性表達(dá)的調(diào)節(jié),1、肝

58、專一性表達(dá)肝專一性表達(dá)多采用磷酸烯醇式酮酸羧激酶的啟動(dòng)子。McGrane  等用了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)使該啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，證明該啟動(dòng)子專一性地在肝和腎等中表達(dá)；Hatzoglau等用PEPCK啟動(dòng)子與neo基因或牛生長(zhǎng)因子重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。克隆后經(jīng)腹腔注射入子宮感染鼠胎肝或注入門靜脈并切除部分肝，證實(shí)前病毒可整合肝細(xì)胞基因組，并持續(xù)表達(dá)了八個(gè)月之久，而且牛生長(zhǎng)因子表達(dá)量受食物刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)。,另一個(gè)肝專一性表達(dá)的片段是A-

59、胰蛋白酶基因的順式作用因子。Simon等的研究表明，α-AT基因上游是決定肝專一性表達(dá)的片段，（-137～37）為最短的肝專一性表達(dá)的片段。Peng等用α-AT的（-730-30）片段與SV40啟動(dòng)子融合驅(qū)動(dòng)人苯丙氨酸羥化酶基因，使其在肝臟專一性表達(dá)，為苯丙酮尿癥基因治療奠定了基礎(chǔ)。,α-FP為肝癌細(xì)胞特有的高效表達(dá)產(chǎn)物，Watanabe等發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)控區(qū)（-3700～3300）決定了α-FP在肝癌中的專一性表達(dá)。Huber等將片段與你

60、腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒后轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，然后給予無(wú)毒性原藥-阿拉伯糖核苷，只有肝癌細(xì)胞才專一性地合成TK，Pro-ara-MF轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性ara-ATP，造成肝癌細(xì)胞的死亡，而其它感染了α-EF-TK的細(xì)胞不受影響。,受體介導(dǎo)靶向基因治療,,2、肌肉專一性表達(dá) 肌肉中高效表達(dá)的是肌苷激酶的調(diào)控片段。Johnson等發(fā)現(xiàn)MCK調(diào)控區(qū)有兩個(gè)增強(qiáng)子：一個(gè)位于（-1256～1049），決定肌肉和心肌專一性表達(dá)，另一個(gè)位于第一內(nèi)含子

61、（738～1599），只決定在心肌的高效專一性表達(dá)。Cox等用這兩個(gè)增強(qiáng)子使Dystrophin在肌肉的表達(dá)量增強(qiáng)50倍，完全糾正了mdr鼠肌肉病理變化，而且無(wú)付作用，最近，Yao等用2分MCK增強(qiáng)子（-1350～1048）使人凝血因子IX在肌母細(xì)胞中得到高效表達(dá)。3、乳腺專一性表達(dá) 在乳腺中專一性表達(dá)的基因有β酪蛋白，乳清酸蛋白，鼠乳腺腫瘤病毒，三都調(diào)控區(qū)中的負(fù)調(diào)控片段決定他們僅在乳腺組織中表達(dá)。,4、黑色素瘤專一性表達(dá) 黑色

62、素瘤特異性表達(dá)酪氨酸和酪氨酸相關(guān)蛋白。決定酪氨酸專一性表達(dá)的片段是在該基因上游（-270～1），決定TRP-1專一性表達(dá)的區(qū)域?yàn)椋?640～165），Hart等用上述調(diào)控區(qū)與Gal報(bào)告基因融合，在人與鼠的黑色素瘤細(xì)胞中均檢測(cè)到其表達(dá)。5、膠質(zhì)瘤專一性表達(dá) 目前已知鞘磷酸堿性蛋白基因上游（-1300～1）片段決定其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的專一性表達(dá)，Miyao等用該片段與HTK基因融合，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在1μMganciclovir培養(yǎng)液中

63、，90%膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，而對(duì)照組生長(zhǎng)不受影響。6、肺癌專一性表達(dá) 人表面活性蛋白A是大多數(shù)肺癌表達(dá)的物質(zhì)。Smith 等用SPA-1上游（-2600～178）片段驅(qū)動(dòng)HSV-TK基因，轉(zhuǎn)化肺癌細(xì)胞株H441 ，給予ganciclovir后，H441大量死亡。,基因治療當(dāng)前的應(yīng)用,基因治療的例子,遺傳病Adenosine deaminase gene transfer to treat Severe Combined Immuno

64、-Deficiency (SCID)CFTR gene transfer to treat Cystic Fibrosis (CF)Advanced Central Nervous System (CNS) MalignancyMesotheliomaOrnithine Transcarbamylase DeficiencyHemophiliaSickle Cell Disease癌癥肺癌：p53乳腺癌：BRAC1前

65、列腺癌：p53肝癌：IFNaCNS腫瘤：TK等自殺基因,One developing technology that may be utilized for gene therapy is nuclear transfer (“cloning”).,基因治療的未來(lái)技術(shù)：核轉(zhuǎn)移,干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于基因治療,免疫技術(shù)應(yīng)用于基因治療,基因治療的安全性,患有罕見(jiàn)的單基因遺傳病的Gelsinger是美國(guó)首位明確由基因治療導(dǎo)致喪生的患者。200

66、0年3月7日，為進(jìn)一步加強(qiáng)臨床試驗(yàn)監(jiān)查力度，F(xiàn)DA和NIH公布了兩項(xiàng)新措施：（1）制定了基因治療臨床試驗(yàn)臨查計(jì)劃；（2）定期開(kāi)辦基因治療安全性專題研討會(huì)。,基因治療的倫理學(xué)問(wèn)題,將基因治療于非疾病情形如增強(qiáng)機(jī)能或“化妝”目的基因治療用于治療禿發(fā)：將生發(fā)相關(guān)基因?qū)朊壹?xì)胞中將生長(zhǎng)激素基因?qū)胍鹁奕水a(chǎn)生將營(yíng)養(yǎng)基因?qū)胍栽黾蛹∪膺_(dá)到健美目的胚胎體細(xì)胞基因治療只有確切證實(shí)的嚴(yán)重遺傳病，在權(quán)衡利弊后才進(jìn)行胚胎體細(xì)胞基因治療克隆和