分子診斷基因治療

1、一 概述： 病理學(xué)在經(jīng)歷了幾個階段 器官病理學(xué) 組織病理學(xué) 細(xì)胞病理學(xué) 免疫病理學(xué),分子病理學(xué)： 應(yīng)用細(xì)胞分子生物學(xué)的理論和技術(shù)方法，對人類疾病發(fā)生發(fā)展、發(fā)病原因、機(jī)制、疾病的形態(tài)變化從分子or基因水平加以認(rèn)識。 病理學(xué)診斷也由以形態(tài)學(xué)觀察為基礎(chǔ)逐步進(jìn)入分子水平，既分子診斷—以探查基因的變化來達(dá)到診斷疾病的目的。,分子診斷的特點： 靈敏

2、度高：基因雖然微量，難以檢測，但目前已有使用基因or其片段高度擴(kuò)增的PCR技術(shù)，以及應(yīng)用高靈敏度的基因探針，即可探測。 特異性強(qiáng)：基因診斷檢測的目標(biāo)是基因，不同的基因的堿基序列各不相同，檢測基因的分子生物學(xué)方法亦是高度特異性的。 適用范圍廣。,目前主要應(yīng)用于： 人類遺傳病的基因診斷or產(chǎn)前診斷；腫瘤； 感染性疾病病原體（細(xì)菌，病毒）； 多基因??；組織器官移植配型； 法醫(yī)學(xué)—個人識別（個人特

3、異性的DNA指紋圖）； 親子鑒定。 其中腫瘤的分子診斷涉及到，多種惡性腫瘤、癌前病變。 診斷的基因涉及多種癌基因，抑癌基因及相關(guān)基因。,,二 分子診斷在腫瘤研究中的意義和應(yīng)用1 腫瘤易感基因的檢測： 腫瘤分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤的發(fā)生具有 遺傳學(xué)基礎(chǔ)，故腫瘤遺傳相關(guān)的易感基因檢測對 于腫瘤高危人群的篩測具有實用價值。 已明確的腫瘤易感基因及相關(guān)腫瘤有：,Rb1

4、-視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，為抑癌基因，定位于13q14.1 染色體, 基因產(chǎn)物位于細(xì)胞核。 APC-家族性腺瘤性息肉病，該基因定位于5q21染色體, 基因產(chǎn)物位于細(xì)胞膜，功能不清。WT1-腎母細(xì)胞瘤，該基因定位于11p13染色體, 基因產(chǎn) 物位于細(xì)胞核。BRCA1-乳腺癌，卵巢癌等，該基因定位于17q21染色體, 基因產(chǎn)物位于細(xì)胞核，為核內(nèi)磷酸化蛋白與激素信 號傳導(dǎo)有關(guān)。,抑癌基因與相關(guān)腫瘤抑癌

5、 染色體 基因產(chǎn) 遺傳性腫瘤 散發(fā)性腫瘤基因 定位 物定位Rb 13q14 核內(nèi) 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 膀胱癌 乳癌 食道癌 肺癌P53 17p13 核內(nèi) 膀胱癌 乳腺癌 食道癌 肺癌 肝癌 卵巢癌

6、淋巴瘤DCC 18q12 胞膜 結(jié)腸癌 直腸癌APC 5q21 胞漿 家族性多發(fā)性腺瘤 結(jié)腸癌 直腸癌 胃癌 胰腺癌WT1 11p13 核內(nèi) Wilm’s瘤 Wilm’s瘤P16 9q21 核內(nèi) 黑色素瘤 黑色素瘤 膀胱癌 乳腺癌 肺癌 腎癌 卵巢

7、癌BRCA1 17q21 胞漿 乳腺癌 卵巢癌 乳腺癌 卵巢癌 結(jié)腸癌 直腸癌 前列腺癌,2 腫瘤的分類： 對BCR區(qū)基因重排的檢測，可對慢性粒細(xì)胞性白學(xué)病進(jìn)行診斷，該基因定位于22q染色體, 該基因稱為斷裂點群區(qū)域基因，9q上的AB1基因與22q34.36區(qū)域基因序列相融合。 對N-myc和C-myc的擴(kuò)增和表達(dá)檢測，對鑒別神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)上皮瘤具有應(yīng)用價值。

8、N-myc明顯擴(kuò)增和過度表達(dá)--神經(jīng)母細(xì)胞瘤。C-myc的擴(kuò)增和過度表達(dá)--神經(jīng)上皮細(xì)胞瘤。,3 腫瘤的早期診斷： K-Ras基因突變，在胰腺癌，結(jié)腸癌，肺癌中發(fā)生率較高，其突變點在第12編碼子最常見。應(yīng)用針吸活檢檢測胰腺癌中第12編碼子突變，檢出率達(dá)100%。 K-Ras基因編碼鳥苷酸結(jié)合蛋白，與GTPase結(jié)合。其突變降低了Ras蛋白與GTPase的結(jié)合能力，導(dǎo)致Ras蛋白與GTP的持續(xù)結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞的

9、生長作用。,4 腫瘤的預(yù)后判斷： 腫瘤相關(guān)基因的突變，擴(kuò)增及過表達(dá)等改變常與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。如，P53基因突變與乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌等多種腫瘤預(yù)后相關(guān)。 P53基因位于17p13，基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，編碼393個氨基酸組成的53KD的核內(nèi)磷酸化蛋白，具有蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合的功能，p53是細(xì)胞周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控，DNA修復(fù)，細(xì)胞分化，細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。,腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達(dá)水

10、平與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。 Nm23位于17q22，基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿，基因功能 不太清楚。CerbB-2基因的過表達(dá)與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。 上皮生長因子受體，為磷酸化蛋白。,5 腫瘤的預(yù)見性治療： 腫瘤的發(fā)生是多基因，多步驟，多階段的過程。在腫瘤發(fā)生，發(fā)展的不同時期，可能涉及不同的基因和不同的變化形式，與腫瘤臨床治療敏感性密切關(guān)聯(lián)。如能在分子水平上對腫瘤基因變化提供指標(biāo)，則對腫瘤的預(yù)見性治療具有指導(dǎo)意

11、義。如90%的胰腺癌，50%的結(jié)腸癌，30%的非小細(xì)胞肺癌存在Ras基因的激活，對放療具有抵抗性，如能從基因水平上改變異常的基因狀態(tài)，則可提高放療敏感性。,起動階段 促進(jìn)階段 進(jìn)展階段　　　　　　　　↓　　　　　　　　↓　　　↓正常胃粘膜→萎縮性胃炎→腸化→異型增生→原位癌→轉(zhuǎn)移癌　　　　　　　　↑　　　　　　　　↑　　　↑基因點突變 基因擴(kuò)增 基因缺失or過量表達(dá)

12、 or重排 Ras, P53 erbB2, EGFR Apc,P53, P16, Rb, nm23,6 腫瘤的預(yù)后監(jiān)測： 如用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)可使白血病細(xì)胞檢出率達(dá)到1/106左右，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測周圍血中的腫

13、瘤細(xì)胞，可提高對腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測的準(zhǔn)確性。分子診斷在腫瘤的監(jiān)測方面具有重要意義。 腫瘤的分子診斷主要集中于對癌基因，抑癌基因及相關(guān)基因的檢測，分別在蛋白質(zhì)，RNA和DNA水平進(jìn)行判斷。,三 腫瘤基因過表達(dá)及其檢測 1 基因過表達(dá)的形式： 癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵因素，癌基因的激活有多種表現(xiàn)形式，其中基因產(chǎn)物過表達(dá)為形式之一。 癌基因一般為單拷貝基因，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)

14、制過程中形成多拷貝，這種基因的擴(kuò)增，使得基因過表達(dá)，表現(xiàn)為mRNA和蛋白質(zhì)量的增加。 抑癌基因在正常情況下維持細(xì)胞的正常周期。P53其野生型基因產(chǎn)物半衰期短而不易檢測到，但突變后其產(chǎn)物半衰期延長。,人類腫瘤中的癌基因擴(kuò)增癌基因 腫瘤及擴(kuò)增百分比（%）C-myc 乳腺癌(15-23), 結(jié)腸癌(3-6)

15、 肺鱗狀細(xì)胞癌(12-25)N-myc 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(10-31)c-myc, N-myc or L-myc 肺小細(xì)胞癌(11-23) C-myc or L-myc 肺腺癌(2-11)ErbB-2 乳腺癌(16-33), 胃癌和食道癌(5-13),

16、 卵巢癌(20-33)K-ras 乳腺癌(3), 卵巢癌(4-8), 肺癌(4),幾種常見腫瘤癌基因的擴(kuò)增率 基因 腫瘤類型 擴(kuò)增率(%) 基因 腫瘤類型 擴(kuò)增率(%) C-erbB-2 乳腺癌 16-33 N-Myc 肺腺癌

17、 2-11 胃，食道癌 5-13 K-Ras 乳腺癌 3-10 卵巢癌 20-33 胰腺癌 45 膽囊癌

18、 45-58 卵巢癌 8-8 肝癌 25-45 膽囊癌 30-61C-Myc 乳腺癌 25-30 N-Ras

19、 肝癌 24 結(jié)，直腸癌 3-6 膽囊癌 40-60 肝癌 25-42 肺鱗癌 15-25,2 基因過表達(dá)的檢測：1） 表達(dá)產(chǎn)物的檢

20、測： 癌基因，抑癌基因其蛋白產(chǎn)物的過表達(dá)可以應(yīng)用相應(yīng)的抗體，通過免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）方法檢測腫瘤組織中蛋白產(chǎn)物，or蛋白印跡(Western Blot)以及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測腫瘤細(xì)胞or血清中的蛋白產(chǎn)物。 免疫組化：在組織切片上進(jìn)行。 特點-是保持組織結(jié)構(gòu)的條件下原位進(jìn)行分析。 ELISA是在細(xì)胞懸液中進(jìn)行。,Western bl

21、ot 既可對組織細(xì)胞進(jìn)行分析，也可對釋放至血液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞儀（Flow cytometry） 新一代測定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法,首先標(biāo)記熒光于相應(yīng)的抗體蛋白，與含有特異性抗原的細(xì)胞結(jié)合后，用流式細(xì)胞儀對不同熒光信號的細(xì)胞進(jìn)行分類、測試。 在已報道的研究結(jié)果中，許多腫瘤都存在其相關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物過表達(dá)。如乳腺癌—C-erbB-2表達(dá)，陽性率50%，P53 為50%，并與其組織學(xué)類型、浸潤、轉(zhuǎn)移傾向和預(yù)后

22、有關(guān)。P53基因產(chǎn)物在大多數(shù)腫瘤中都有過表達(dá)，包括胃癌，直腸癌，肺癌，食道癌，肝癌，卵巢癌等。,2）基因擴(kuò)增的檢測： 腫瘤基因的擴(kuò)增可產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白，此外表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的增加，可通過分子診斷方法進(jìn)行檢測。 經(jīng)典的方法： 核酸分子雜交—原位雜交 （In situ hybridization,ISH） Southern blot(DNA雜交)，Northern b

23、lot(RNA雜交)， 原位PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR。,核酸分子雜交： 是檢測核酸分子間序列同源性的一種技術(shù)。不同來源的核酸單鏈只要彼此間有一定的互補(bǔ)順序，即可按堿基配對規(guī)則以氫鍵相結(jié)合。通常是先對一種核酸進(jìn)行標(biāo)記（如放射性同位素or熒光素、生物素等）作為探針，去探測另一核酸序列。先經(jīng)過變性使DNA雙鏈分開成單鏈，再進(jìn)行雜交，可以是DNA-DNA, RNA-RNA, or DNA-RNA之間進(jìn)行。,原位雜交： 用標(biāo)記

24、的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。 用原位雜交技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)癌基因的mRNA可檢出激活的癌基因。用不同種類的癌基因探針檢測同一種癌組織內(nèi)mRNA可以明確有哪些基因被激活。,Southern blot： 1975年由Southern提出并以其名字命名的一種DNA特定序列定位技術(shù)。 基本原理—從組織細(xì)胞中提取基因組DNA，用一種or多種限制性內(nèi)切酶酶切，通過電泳，轉(zhuǎn)膜，原位變性

25、固定于固相支持物（硝酸纖維濾膜or尼龍膜），用已標(biāo)記的特異性DNA or RNA探針與固定有DNA的固相支持物雜交，經(jīng)放射自顯影or化學(xué)發(fā)光自顯影，對顯影條帶進(jìn)行分析?？梢源_定在眾多酶解產(chǎn)物中某一特定序列DNA片段的位置和大小。最常見的研究對象為基因組DNA，也可以用于質(zhì)粒DNA的片段分析。,Northern blot： 1977年Alwine等提出的一種類似于Southern的方法，主要用于分析mRNA。 基本程序—提

26、取組織細(xì)胞中的RNA--電泳，原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上--雜交--放射自顯影or化學(xué)發(fā)光自顯影—結(jié)果分析。以顯示目標(biāo)RNA所存在的位置，含量。,PCR—聚合酶鏈反應(yīng)： 1983年美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，1985年公開報道，該技術(shù)的發(fā)明在生命科學(xué)中掀起了一場革命。其實質(zhì)就是一種在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將特定的DNA序列進(jìn)行高效，快速擴(kuò)增的技術(shù)。 反應(yīng)體系： Taq酶（屬DNA聚合酶）。 合

27、成的DNA引物。 Mg2＋, 緩沖液—提供反應(yīng)合適的酸堿度。 三磷酸脫氧核苷酸dNTP。,原位PCR： 1992年建立。在組織細(xì)胞原位進(jìn)行DNA擴(kuò)增的定位，定性研究方法。PCR擴(kuò)增技術(shù)＋原位雜交技術(shù)相結(jié)合，通過PCR技術(shù)對靶核苷酸序列在染色體上or組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增，使基因拷貝數(shù)放大，再通過原位雜交方法檢測，以達(dá)到對靶核苷酸進(jìn)行定位，定性，定量分析。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）： 為RNA的快

28、速體外擴(kuò)增的一種技術(shù)。RNA的擴(kuò)增需將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶來完成，首先合成的第一條鏈cDNA，以cDNA作為模板，再用特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。,四 基因突變及其檢測 基因突變的結(jié)果使癌基因激活或抑癌基因失活，細(xì)胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。 腫瘤細(xì)胞—可檢測到突變的基因。 癌前病變or癌前狀態(tài)組織細(xì)胞—存在不同形式和不同程 度的基因突變。,1 基因突變的形式： 點突變—指基因在特定位置發(fā)生一個核苷

29、酸的改變， 使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì) 的空間構(gòu)型和生物學(xué)功能。 研究表明，大部分的腫瘤幾乎都存在相應(yīng)基因的點突變 如肺癌，膀胱癌，結(jié)腸癌，胃癌，乳腺癌等存在H-Ras, K-Ras, N-Ras的第12，13，61編碼子的點突變。 P53, P16, P15等幾種抑癌基因也在多種腫瘤中存在點 突變。,人類腫瘤中的Ras基因突變Ras突變百分比（%）

30、 活化的Ras基因肺腺癌 30 K-Ras結(jié)腸腺癌 50 K-Ras胰腺癌 90 K-Ras膽管腺癌

31、 90 K-Ras膀胱癌 6 H-Ras乳腺癌 ＜5 K-Ras宮頸癌 25

32、 H-Ras甲狀腺癌 ＞60 H-Ras, K-Ras, N-Ras黑色素瘤 20 N-Ras精原細(xì)胞瘤 40 K-Ras, N-Ras

33、,人類腫瘤中P53基因突變熱點和頻率腫瘤類型 突變頻率 突變熱點(編碼子)肺癌 56 157，248，273結(jié)腸癌 50 175，245，248，273食道癌 45 不確定卵巢癌 44 273

34、胰腺癌 44 273皮膚癌 44 248，278胃癌 41 不確定,人類腫瘤中P53基因突變熱點和頻率腫瘤類型 突變頻率 突變熱點(編碼子)頭頸部鱗癌 37 248膀胱癌

35、 34 280肝細(xì)胞癌 45 249乳腺癌 22 175，248，273甲狀腺癌 13 248，273宮頸癌 7 273,基因缺失—指基因片段的缺失（Gene loses）

36、，缺失的范圍差異較大，可以是1-2個堿基，也可以是一個片段。是另一種主要的突變形式。常見的缺失位點如乳腺癌的3p 7q 11p 13q 16q 17p等，結(jié)腸癌的5q 17p 18q等?；蚱蔚娜笔Э墒乖摶蚣せ?、轉(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學(xué)功能喪失?；蛉笔悄[瘤形成的原因還是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后的結(jié)果，仍值得深入探討。,基因易位或重排—某一基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個位置上稱易位or重排（Gene tran

37、slocation and rearrangement）。易位與重排易使癌基因被激活，或使抑癌基因失活，從而使細(xì)胞惡變。細(xì)胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進(jìn)子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時，可使細(xì)胞癌基因與正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，而使其活化。Burkitt淋巴瘤 c-myc基因 8q24易位于2p11。慢性or急性粒細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白

38、血病，癌基因Ab1從9號染色體易位于22號染色體。9q34—22q11。Ewing肉瘤，SiS基因從22號染色體易位于11號染色體。SiS基因編碼生長因子類癌基因，其產(chǎn)物為PDGF-血小板生長因子亞單位，作用于PDGF受體，使細(xì)胞增殖。,幾種常見腫瘤的染色體易位常見腫瘤 染色體易位 涉及的癌基因小無裂細(xì)胞淋巴瘤 t(8; 14)(q24; q32)

39、 c-Myc濾泡性淋巴瘤 t(14;18)(q32;q21) Bcl-2Burkitt淋巴瘤 t(8;2)(q24;p11) c-Myc t(8;14)(q24;q23) c-Myc

40、 t(8;22)(q24;q11) c-MycEwing肉瘤 t(11;22)(q24;q12) c-Sis透明細(xì)胞肉瘤 t(12;22)(q13;q12) ？滑膜肉瘤 t(X;18)(p11;q11.2) ？橫紋肌肉瘤

41、 t(2;13)(q35;q14) ？,2 基因突變的檢測方法： PCR-SSCP法：單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（single-strand conformational polymorphism, SSCP）是在非變性聚丙烯酰凝膠上電泳,短的單鏈DNA和RNA分子依其堿基序列不同而形 成不同構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，

42、這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使存在一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)不同的遷移率。由于該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。特別適合大樣本基因突變的篩選工作。 技術(shù)要點：在PCR反應(yīng)中摻入放射性同位素以標(biāo)記被檢DNA，其產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰凝膠上電泳。 缺點：該法不能測定突變的準(zhǔn)確位點，還需要通過序列分析來確定。,雜合雙鏈分析法(Heteroduplex analysis, HA)： 將突變

43、型-野生型DNA雙鏈進(jìn)行雜交，由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA，在其錯配處形成突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率。,等位基因特異性寡核苷酸分析法： 等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide, ASO）為一種以雜交為基礎(chǔ)對已知突變的檢測技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此