pcr原理及其操作

1、PCR反應(yīng)原理及其操作,,,1.PCR的基本原理 2.PCR反應(yīng)體系 3.PCR的基本步驟 4.PCR反應(yīng)五要素 5. PCR 的反應(yīng)流程,PCR的基本原理,試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板

2、延伸為雙鏈DNA。,PCR反應(yīng)體系,4種dNTP混合物 各200umol/L引物 　　　　 各10～100pmol模板DNA 　　　 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 　　　　　 1.5mmol/L,PCR的基本步驟,,72℃,,94℃,55℃,,,,,,PCR循環(huán),PCR的基本步驟,1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合

3、（55℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃，30～60s）,PCR的基本步驟,,重復(fù)1~3步25~30輪,,,,,,,,,目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA變性形成2條單鏈,DNA單鏈與引物復(fù)性,子鏈延伸DNA加倍,,,高溫變性,低溫退火,中溫延伸,,,,,,,,,,,PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（

4、退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。,,理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），25～30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。以上“變性

5、、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。,PCR擴(kuò)增曲線,PCR反應(yīng)五要素,1. 引物（primer）2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）,1.引物,引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)

6、互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。,引物設(shè)計(jì)的原則,①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右；②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb；③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)：避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)

7、，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶；⑤引物3’端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)：特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗；⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處；⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性；⑧引物量：每條引物的濃度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增

8、，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),,2 .酶及其濃度,目前有兩種Taq DNA 聚合酶供應(yīng)：天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100µl時(shí)）；濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。,3.dNTP的質(zhì)量與濃度,dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系：dNTP呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)

9、應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP 能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,4.模板（靶基因target g

10、ene）,模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一；傳統(tǒng)DNA純化方法：采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本；SDS：是溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白, 再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。臨床檢測標(biāo)本：可采用

11、快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增；RNA模板提?。翰捎卯惲蚯杷犭一虻鞍酌窴法，要防止RNase降解RNA,5.Mg2+濃度,Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響;在一般的 PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200µmol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L為宜;Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過低會(huì)降低 Taq D

12、NA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。,PCR 的反應(yīng)流程,溫度與時(shí)間的設(shè)置循環(huán)次數(shù),1、溫度與時(shí)間的設(shè)置,設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃退火，然后快速升溫至70～75℃延伸，對(duì)于較短靶基因（長度100～300bp）可采用二溫度點(diǎn)法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。,① 變性溫度與時(shí)間：,一般93℃～94℃，1min足

13、以使模板變性若低于93℃則需延長時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。,② 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：,退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想,,Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大

14、大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合,引物的復(fù)性溫度通過以下公式幫助選擇合適的溫度：,③ 延伸溫度與時(shí)間：,延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠） 3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10kb需延伸至15min