[學(xué)習(xí)]定量pcr基本原理及方法

1、定量PCR基本原理及方法,基因有限公司 黃妤,熒光定量PCR基本原理熒光定量PCR標(biāo)記方法熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用,內(nèi)容,,定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用EB加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度核酸 ? 染料熒光后來(lái)用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBR Green I取代EB,熒光定量PCR基本原理,,Real-time Chemistries,PC

2、R的理論方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：擴(kuò)增物數(shù)量； X ：起始模板數(shù)量；Ev：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù),1. 終點(diǎn)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù))2. 實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同Ev以、擴(kuò)增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)（X）與其所需要的擴(kuò)增

3、循環(huán)次數(shù)（n）成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b為常數(shù)),熒光定量PCR的定量原理,n: 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定,logN=log N0 +nlogE n=Ct每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,Ct值與起始模板的關(guān)系,

4、,Y軸—Ct值,X—起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),,,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板濃度,log N0 =-Ct logE+logN,絕對(duì)定量——未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比較,內(nèi)摻式染料 SYBR Green I, LC Green 序列特異性探針 Taqman Molecular Bea

5、cons FRET 引物特異性探針Amplifluor (Intergen) LUX,熒光定量 PCR 標(biāo)記方法,內(nèi)摻式染料 SYBR-Green I,內(nèi)摻式染料 SYBR-Green I,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）

6、,X,,,分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe）,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,,,,,熒光共振能量傳遞（FRET Probe）,熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用,研究目的 標(biāo)記方法,定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對(duì)定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc,研究目的,基

7、因型分析（SNP、突變型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green,熔解曲線(xiàn)分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET,某科研用戶(hù)使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 （自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做復(fù)管）,,絕對(duì)定量,某科研用戶(hù)使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定量分析，下圖為用??Ct法

8、得出的分析結(jié)果 。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做3次重復(fù)復(fù)管）,HouseKeeper Gene,Gene of Interest,相對(duì)定量,利用溶解曲線(xiàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化（RG3000）,熔解曲線(xiàn)分析,Annealing at 60℃,Annealing at 63℃,標(biāo)記方法,Taqman 定量分析，基因型分析,Sybr-Green 定量分析，熔解曲線(xiàn)分析，基因型分析 (LC Green),Molecular Beacon

9、 定量分析，熔解曲線(xiàn)分析，基因型分析,FRET 定量分析，熔解曲線(xiàn)分析，基因型分析,Ampliflour Probe，LUX 定量分析,基因型分析,利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型 —— Taqman根據(jù)熔解曲線(xiàn)的不同來(lái)分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green,,,,雙T

10、aqman探針?lè)z測(cè)野生型和突變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針（分別針對(duì)野生型和突變型)，即一個(gè)突變型探針以一種熒光素（Flr）標(biāo)記，而野生型探針則用不同的熒光物（Tet）標(biāo)記。如果只有一種信號(hào)被擴(kuò)增出來(lái)，則樣本為對(duì)應(yīng)的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地?cái)U(kuò)增出來(lái)，則樣本為雜合型。,利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型,雜合型,野生型,突變型,,FRET探針進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析確定基因型

11、 FRET探針與模板結(jié)合時(shí)，因共振能量的傳遞而信號(hào)增強(qiáng)，而當(dāng)在Tm 值時(shí)，F(xiàn)RET探針與PCR產(chǎn)物分開(kāi)，熒光信號(hào)減弱。通過(guò)實(shí)時(shí)捕捉到的PCR產(chǎn)物在熔解過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)。因?yàn)榘l(fā)生基因突變的PCR產(chǎn)物有特定的Tm 值，通過(guò)測(cè)定探針與PCR產(chǎn)物分開(kāi)時(shí)的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。,利用熔解曲線(xiàn)檢測(cè)基因突變,雜合型,野生型,突變型,利用內(nèi)摻式染料進(jìn)行高分辨率熔解曲線(xiàn)（HRM）分析基因型HRM根據(jù)