1摘要核桃系胡桃科核桃屬植物

1、克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產(chǎn)物，載體和目的DNA在連接反應中的比例必須適當。載體與目的DNA的摩爾比過高，會造成大量的環(huán)化空質(zhì)粒，既可能是單一質(zhì)粒的環(huán)化，也可能是多個質(zhì)粒聚集而形成的環(huán)化。摩爾比如果過低，則會產(chǎn)生過量的在大小、方向和組成上各不相同的線狀和環(huán)狀的均質(zhì)或異質(zhì)性多聚體。為此，每一重組體中外源DNA的連接方向和插入數(shù)量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。本實驗以載體與目的片段的摩爾比為1:10

2、進行連接，同時應用三種不同的限制性內(nèi)切酶進行多重鑒定，取得了滿意的實驗結(jié)果。連接體系中高濃度的平端，也是獲得平端連接的必要條件。在載體和目的片段的摩爾比適當?shù)臈l件下，盡量加大各自的摩爾濃度，以縮小載體片段末端與目的片段末端在空間上的距離，從而加大二者的碰撞幾率，減小載體片段的自身環(huán)化連接。本實驗主要從以下幾點來加大連接體系中載體片段和目的片段的平端濃度：1）提取質(zhì)粒DNA時盡量做到高濃度、高質(zhì)量；2）酶切時，在不影響酶切效果的情況下，加

3、大酶切體系中質(zhì)粒DNA的濃度；3）凝膠電泳分離目的DNA時，加入大量酶切產(chǎn)物，膠回收時盡量少帶膠，切下的膠中目的片段的濃度盡量高，從而使回收的溶液中DNA片段的濃度盡量高；4）連接體系盡可能小（一般5~10μl），體系中除T4噬菌體DNA連接酶和相應的緩沖液外，全部由兩種膠回收溶液按特定比例填充。低濃度（0.5mmolL）的ATP和極高濃度的連接酶也是平端連接的必要條件。在反應混合物中，ATP作為10連接緩沖液的組分，給載體和外源DNA

4、片段提供了更為廣闊的空間。本實驗中廠家提供的連接緩沖液含有ATP，因而沒有另外加入ATP。此外，平端連接是低效反應，連接反應的時間相對較長，所以應加入極高濃度的連接酶。去除載體5’端的磷酸基可防止質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，這一點在不少書籍中提到。但對于去磷酸化處理是否有利，各家的觀點不盡相同，有很多研究者對去磷酸化的作用持有疑問。毫無疑問，去除5’端的磷酸基可抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，因而降低帶有“空”質(zhì)粒的細菌克隆所產(chǎn)生的背景。因而，也會

5、經(jīng)常發(fā)生同時使帶有重組質(zhì)粒的克隆減少的情況。此外，去磷酸后，必須對堿性磷酸酶進行充分滅活，以保證下一步的連接反應順利進行，但滅活過程中進行抽提時，大大降低了質(zhì)粒DNA的濃度，不容易操作。本實驗初期嘗試應用堿性磷酸酶去除載體5’端的磷酸基，效果并不理想。鑒于這些原因，本實驗不推薦使用這一方法。在連接反應混合物加入一些可促進大分子群聚作用并可導致DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)，如聚乙二醇或氯化六合高鈷，可以使如何取得適當濃度的平端DNA問題迎

6、刃而解。但考慮到這些物質(zhì)的加入也增強了連接產(chǎn)物的硬度，大大降低了連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率，所以本實驗并沒有應用這類物質(zhì)。1摘要核桃系胡桃科核桃屬植物，在我國分布范圍廣闊。本文首先以普通核桃的不同部分為研究對象，確定各部分多酚類物質(zhì)的組成及含量的分布；再以普通核桃、不老屯核桃、美國黑核桃為試驗材料，重點研究不同品種核桃青皮中多酚類物質(zhì)的成分、含量及抗氧化活性。試驗結(jié)果表明：核桃中對人體有益的多酚類物質(zhì)主要集中在青皮、種皮部分，且青皮中多

7、酚類物質(zhì)的絕對含量相對較高；在不同品種核桃青皮的多酚類物質(zhì)中，從總酚含量、單寧含量及胡桃醌含量看，美國黑核桃青皮均最高，其次為普通核桃青皮，不老屯核桃青皮均最少。從所擁有的多酚類物質(zhì)種類數(shù)看，普通核桃青皮的最多，其次為美國黑核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。在三個品種的酚酸類物質(zhì)中，沒食子酸含量均是最高的，且從其含量看，不老屯核桃青皮最高，其次為美國黑核桃青皮，普通核桃青皮最少。在三個品種的黃酮類物質(zhì)中，蘆丁的含量均是最高的，且從其含量上看

8、，美國黑核桃青皮最高，其次為普通核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。從抗氧化性看，利用DPPH自由基的反應體系進行清除自由基實驗，美國黑核桃青皮清除自由基的能力最強，其次為不老屯核桃青皮，..............................................................................123.1.1核桃果實不同部位的多酚類物質(zhì)的提取...........................

9、..............123.1.2不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)的提取.................................................123.2核桃多酚類物質(zhì)的顯色反應................................................................123.3核桃總酚的測定—普魯士藍法....................................

10、........................123.3.1標準曲線的制作................................................................................123.3.2樣品的測定........................................................................................13

11、3.4核桃單寧的測定:蛋白質(zhì)沉淀法..........................................................133.5核桃PPC的測定..................................................................................143.5.1標準曲線的制備....................................

12、............................................1443.5.2PPC（沉淀蛋白質(zhì)的量樣品重量）的測定....................................143.6核桃青皮中多酚類物質(zhì)的組成的HPLC色譜測定...........................153.6.1酚酸類.................................................

13、..............................................153.6.2黃酮類...............................................................................................153.7核桃青皮中總黃酮的測定.....................................................

14、..............153.7.1定性實驗－紫外吸收光譜...............................................................153.7.2顏色反應...........................................................................................163.7.3標準曲線的制作.........

15、......................................................................163.7.4樣品的測定.......................................................................................163.8不同核桃青皮葉綠素含量的測定................................

16、......................173.9不同核桃青皮胡桃醌的測定...............................................................173.10不同核桃青皮抗氧化活性的測定......................................................174結(jié)果與分析....................................

17、..............................................................184.1核桃果實不同部位的多酚類物質(zhì)分析比較......................................184.1.1核桃果實不同部位的多酚類物質(zhì)的顯色反應結(jié)果........................184.1.2核桃果實不同部位的多酚類物質(zhì)的組成及HPLC分析比較.........194

18、.2不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)分析比較...............................................234.2.1不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)的顯色反應結(jié)果................................234.2.2不同核桃青皮中有關(guān)指標的分析比較............................................234.2.3不同核桃青皮的多酚類物質(zhì)的組成比較及HPLC分

19、析比較.........244.2.4不同核桃青皮的黃酮類物質(zhì)的顯色反應結(jié)果...............................254.2.5不同核桃青皮中總黃酮的測定.....................................................254.2.6不同核桃青皮中胡桃醌的測定.......................................................264

20、.3不同核桃青皮酚類物質(zhì)的抗氧化活性研究.......................................295討論.............................................................................................................306結(jié)論..........................................

21、...................................................................316.1核桃果實不同部位的多酚類物質(zhì)分析比較.......................................316.2不同核桃青皮的多酚類物質(zhì)分析比較...............................................316.3不同核桃青皮的酚類物質(zhì)的抗氧化活性比

22、較...................................3111引言1.1核桃的概況1.1.1核桃的種類及分布核桃（JuglansregiaL）系被子植物門雙子葉植物綱胡桃科（Juglanceae）核桃屬植物，原產(chǎn)于歐洲東南部、東亞及北美地區(qū)，是人類種植最古老的樹生堅果之一[13]。核桃屬（JuglansL）植物分為三個組，核桃組（Sect.Julans）、核桃楸組(Sect.cardiocaryonDode)、黑核桃組