peptide pull down 方案譯文

1、PeptidePulldown方案方案設(shè)計(jì)好的備用肽段（C端末尾加幾個(gè)殘基作為連接臂并且末端偶聯(lián)生物素，）應(yīng)被色譜純化至純度大于80%，等分，凍干，干燥環(huán)境下于—80度儲(chǔ)存1連接肽段的珠子的制備連接肽段的珠子的制備：（注意，制備的所有步驟都應(yīng)在冰上或最多4度的環(huán)境下進(jìn)行）1用1mL磷酸鹽緩沖液加0.1%的表面活性劑TritonX100，沖洗400微升的親和素珠（離心？（microcentrifuge），500RCF，30s）移去上清液，

2、至少洗三次（洗去表面的保護(hù)劑，表面活性劑TritonX100也促使疏水性的珠子與水相分離，否則無法得到上清液）制備兩個(gè)400L的珠子，其中一份不偶聯(lián)肽段作為只有珠子的對(duì)照組。用裝有毛用裝有毛細(xì)管凝膠管凝膠的移液器尖端來取上清液，從而避免移去珠子的移液器尖端來取上清液，從而避免移去珠子2使100微克偶聯(lián)生物素的肽段重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液（PBS）中這些肽段的量足夠配400L偶聯(lián)肽段的珠子，做20次pull—down，如果珠子有著

3、不同的連接生物素能力，注意將肽段和親和素比例調(diào)整合適3將2中制備好的400微升重新懸浮的肽段加入400微升洗過的珠子中，旋轉(zhuǎn)（rotation），在室溫下溫育3到5h也可在4度過夜溫育4用1mLPBS0.1%TritonX100沖洗連接了肽段的珠子至少三次，來移除未連接上的肽段5將偶聯(lián)了肽的珠子重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液中來制備50%的懸浮液，在4度下儲(chǔ)存若長期儲(chǔ)存，加疊氮化鈉到濃度為0.1%，4度下至少可儲(chǔ)存1個(gè)月。甲基化修飾穩(wěn)

4、定，磷酸化修飾不穩(wěn)定2用固定好的肽段從復(fù)雜混合物中釣蛋白用固定好的肽段從復(fù)雜混合物中釣蛋白一些一般原則：一些一般原則：復(fù)雜混合物與珠子的處理復(fù)雜混合物與珠子的處理5每份將80L（50%）的未偶聯(lián)的珠子溶液（含40L珠子），離心使成團(tuán)（500RCF，30s），移除上清液6用500LBufferD(含濃度為150mM的KCl)將珠子至少洗一次（500RCF，30s，移去上清液，避免移走珠子）7將制備的核提取物加到洗過的珠子中，在4度下輕輕旋

5、轉(zhuǎn)（rotation）溫育30分鐘若方便可以增加溫育時(shí)間，然而預(yù)清理時(shí)間在超過30分后，我們?cè)贈(zèng)]能觀察到非特異性連接蛋白背景水平的下降。而且請(qǐng)記住這步不能從數(shù)量上減少非特異性連接的水平（只作為對(duì)照組）8通過離心30秒使珠子集聚成團(tuán)狀（離心力調(diào)整為500RCF），用干凈試管收集上清液來用于pulldown如果需要的話，再離心除去任何殘余珠子9取15uL清澈的核提取物作為input對(duì)照組用于之后的分析偶聯(lián)肽段珠子的準(zhǔn)備偶聯(lián)肽段珠子的準(zhǔn)備10

6、每份取40uL50%的珠子懸浮液（含20uL珠子）偶聯(lián)肽段的珠子的量可以根據(jù)蛋白與它結(jié)合的親和力的強(qiáng)弱來調(diào)整，然而我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)珠子體積超過20uL只能增加背景干擾水平，不能增加特異性連接11離心使珠子集聚成團(tuán)狀，移除所有上清液，保證每份有著大致相同量的珠子通過離心30秒使珠子集聚成團(tuán)狀（離心力調(diào)整為500RCF），用裝毛細(xì)管凝膠的移液管吸頭移去上清液，，在每次pulldown試驗(yàn)中確保使用大致相同的已偶聯(lián)肽段的珠子是很重要的，確保不同肽