世界上最完善最詳細(xì)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)完全黃金版

1、世界上最完善最世界上最完善最詳細(xì)詳細(xì)的神的神經(jīng)元原代培養(yǎng)完全黃金版元原代培養(yǎng)完全黃金版[精華]序言：國(guó)內(nèi)外關(guān)于原代培養(yǎng)有很多文獻(xiàn)，不幸的是，沒有一篇是詳細(xì)的，沒有一篇解答過(guò)why.為了讓大家少走彎路，根據(jù)我殺過(guò)3000只老鼠的經(jīng)驗(yàn)，我把我這幾年摸索的經(jīng)驗(yàn)和大家分享，請(qǐng)求多投幾票得幾個(gè)叮當(dāng)。相信你follow我的這篇文章一定會(huì)做的很好。我的標(biāo)題說(shuō)的很像吹牛，但是我是嚴(yán)肅認(rèn)真的說(shuō)的，Iearnit.note:這篇文章全是我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，99。

2、9%原創(chuàng)，經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)失敗的到的最完美的原代神經(jīng)元培養(yǎng)法，除了最后那一副圖是來(lái)自下面第2行那篇文獻(xiàn)，所以我才說(shuō)是99.9%原創(chuàng)。（注：附錄的圖是常用的消化酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的存活率影響，來(lái)自下面鏈接里的文獻(xiàn)）另外，成年鼠的原代培養(yǎng)我沒有摸索過(guò)，推薦一篇文獻(xiàn)在我以前的帖子（無(wú)需叮當(dāng)）（bbspostviewbid=156&id=17651341&sty=3）本篇專門討論胎鼠和新生鼠神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。1.材料選擇。一定要嚴(yán)格按照國(guó)際上，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其

3、他文獻(xiàn)的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因?yàn)樾律笥幸恍┦荏w，在培養(yǎng)的工作中失去功能，會(huì)不能再生，比如NMDA受體。和文獻(xiàn)不同會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論，甚至困惑。很多人寫信問(wèn)我新生鼠的培養(yǎng)問(wèn)題，我回答用新生鼠的實(shí)驗(yàn)很少，八成是你自己搞錯(cuò)了實(shí)驗(yàn)對(duì)象，請(qǐng)確認(rèn)國(guó)際上的相關(guān)研究文獻(xiàn)所用老鼠，再來(lái)問(wèn)我下面的問(wèn)題。2，培養(yǎng)基選擇（neurbasalneurobasalainvitrogenCo.ltd)。我強(qiáng)烈不建議用血清培養(yǎng)。原因是：首

4、先，血清刺激膠質(zhì)細(xì)胞和雜細(xì)胞分裂，最后非常影響神經(jīng)元產(chǎn)量；其次，為了抑制膠質(zhì)生長(zhǎng)，往往要加入阿糖孢苷。嚴(yán)重的毒性會(huì)影響許多靈敏實(shí)驗(yàn)；再次，最重要的，血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一，從正常到凋亡都有，嚴(yán)重影響試驗(yàn)準(zhǔn)確，而無(wú)血清專用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài)，要么都好，要么都差，高度一致。InvitrogenGIBCO無(wú)血清培養(yǎng)基neurobasal(neurbasalA)被認(rèn)為是最標(biāo)準(zhǔn)，最好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為B27和谷氨酰胺。

5、培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一，膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。其中，neurobasal是關(guān)于POLYLYS包被，我們是包被30分鐘，吸干晾過(guò)夜，然后洗兩次，或者只洗一次但是要30分鐘接著晾干。由于neurobasal培養(yǎng)法相當(dāng)成熟，所以沒必要用難固定的膠原。5.處死母鼠并把胎鼠解剖時(shí)候，一定要注意母鼠狀態(tài)，是否有死胎，胎兒胎盤是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16E18）這些信息也要嚴(yán)格記錄。處死孕鼠后，要立即取出子宮放入冰冷培養(yǎng)液中。注意孕

6、鼠處死后要短暫的浸泡酒精消毒，防止污染。一般來(lái)說(shuō)，冰袋筆者選擇一面藍(lán)一面白的。藍(lán)的朝上，可以很清晰看到海馬結(jié)構(gòu)。而去除血管膜的時(shí)候，白的那面朝上，這樣可以很清楚看到血管膜。從處死老鼠到大腦被剝離出這段是人就會(huì)做，我就不多說(shuō)了。不過(guò)有一點(diǎn)要注意，不管你是用皮層還是海馬，不要取一個(gè)分離一個(gè)，而是要快速把所有胎鼠大腦都迅速取出放到冰預(yù)冷的培養(yǎng)液中。我建議胎鼠取出來(lái)的時(shí)候胎鼠就放在冰冷的緩沖液中。就是說(shuō)，處死后要迅速把大腦的溫度降到0.6：最影

7、響原代培養(yǎng)的成敗因素之一：這小段請(qǐng)大家一定注意看。無(wú)論皮層還是海馬，上面都是有一層血管膜。注意：一定要盡可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖顯微鏡。胎鼠很好剝離，而新生鼠則比較難。這里千萬(wàn)不能粗心大意??！血管膜沒剝離干凈的后果是：1吹打時(shí)候很難吹打下來(lái)神經(jīng)元，被迫多次吹打，造成神經(jīng)元大量死亡；2血管膜一部分細(xì)胞會(huì)混入原代培養(yǎng)中，這些細(xì)胞往往會(huì)分裂，導(dǎo)致你的培養(yǎng)成果根本不能用?？梢哉f(shuō)，剝離的不好不干凈，實(shí)驗(yàn)就是失敗的，不可能得到高質(zhì)量

8、的神經(jīng)元。注意的事情二：如果是要的是皮層的神經(jīng)元原代培養(yǎng)，而皮層的細(xì)胞很多，切忌不要放太多皮層消化吹打！過(guò)多的細(xì)胞反而會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元大量死亡。另外，請(qǐng)仔細(xì)注意文獻(xiàn)中要的是皮層哪一部位。沒有詳細(xì)要求的話一般是取頂端。從大腦到單個(gè)海馬的剝離我不細(xì)說(shuō)了。我現(xiàn)在以海馬神經(jīng)元為例。在所有海馬都成功剝離后，請(qǐng)仔細(xì)的去除血管膜，原因上面說(shuō)過(guò)。最后，請(qǐng)?jiān)僮屑?xì)檢查一下是不是都去掉了。確認(rèn)后，海馬片段被移入一個(gè)小燒杯里，加少量培養(yǎng)液，用剪刀剪成0.51立方毫