多巴胺誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元凋亡.pdf

1、目的：在法醫(yī)檢案中可遇到非致命性機(jī)械性損傷如長時(shí)間限制體位、肢體被壓迫后一段時(shí)間出現(xiàn)精神損傷甚至死亡的案件。由于此類損傷程度輕微，甚至沒有明顯的肉眼可見的外傷，因而此類案件的鑒定工作已經(jīng)成為法醫(yī)工作者面臨的難題。
　　分析此類案件的發(fā)生發(fā)展過程，不難發(fā)現(xiàn)這些案件均存在共同的特點(diǎn)即當(dāng)事人產(chǎn)生不同程度的心理應(yīng)激。研究已經(jīng)證實(shí)，過度而持久的心理應(yīng)激可以引起精神損傷，但具體的分子機(jī)制尚不明確。研究這一科學(xué)問題對于解決此類案件的鑒定工作具有

2、非常重要的科學(xué)意義。
　　應(yīng)激是機(jī)體對各種應(yīng)激原所作出一種適應(yīng)性反應(yīng)。其神經(jīng)-內(nèi)分泌反應(yīng)主要表現(xiàn)為藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的激活，使兒茶酚胺（catecholamine，CA)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid， GC)、胰高血糖素等應(yīng)激相關(guān)激素的水平快速升高，來保證重要生命器官的功能和代謝，具有重要的防御代償意義。但應(yīng)激激素長時(shí)間維持高水平，可引起氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等多種病理過程，這使應(yīng)

3、激的防御代償意義轉(zhuǎn)變?yōu)閷C(jī)體的損傷。
　　CA是應(yīng)激過程中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要激素之一。研究CA對機(jī)體的損傷作用對于闡明應(yīng)激性損害的機(jī)制具有重要意義。多巴胺(dopamine， DA)作為CA的一種，在腦內(nèi)有著廣泛的分布，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)運(yùn)動、獎賞、學(xué)習(xí)、記憶以及情緒方面起著關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明，多巴胺系統(tǒng)在應(yīng)激引起的精神損傷中發(fā)揮重要作用，如精神分裂癥、重性抑郁障礙等。因此研究多巴胺對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用將

4、為闡明心理應(yīng)激導(dǎo)致精神損傷的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　近年來，對于杏仁核的研究越來越多，并且逐漸意識到其在應(yīng)激過程中可能也發(fā)揮著重要作用。杏仁核屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，附著在海馬的末端，與皮層、海馬、下丘腦、腦干、嗅球等都有廣泛的聯(lián)系。杏仁核在恐懼、焦慮形成中發(fā)揮著重要作用，是對恐懼刺激做出反應(yīng)的主要中樞?；加袆?chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）的病人，杏仁核體積變小，并且在PTSD

5、動物模型中，觀察到杏仁核神經(jīng)元損傷[5]。研究表明人杏仁核中有豐富的多巴胺D1和D2受體分布，在應(yīng)激狀態(tài)下杏仁核多巴胺釋放增加，且多巴胺D1受體和多種神經(jīng)心理疾病有關(guān)系。但對于多巴胺是否能引起杏仁核神經(jīng)元凋亡目前尚不清楚。
　　基于以上背景，本實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞水平探討多巴胺是否可通過多巴胺D1受體誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元發(fā)生凋亡，從而為闡明心理應(yīng)激導(dǎo)致精神障礙的機(jī)制提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、原代培養(yǎng)大鼠杏仁核神經(jīng)元，

6、應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法對神經(jīng)元純度進(jìn)行鑒定。
　　2、通過MTS細(xì)胞增殖分析實(shí)驗(yàn)評價(jià)不同濃度多巴胺(10μM、30μM、50μM、100μM、150μM)對杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響，確定最佳濃度后，選取該濃度作用杏仁核神經(jīng)元不同時(shí)間(24h、48h、72h)，采用MTS實(shí)驗(yàn)評價(jià)不同作用時(shí)間對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響。
　　3、用DA處理杏仁核神經(jīng)元后，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法觀察Bax蛋白轉(zhuǎn)移情況，探討DA處理后杏仁核神經(jīng)

7、元是否發(fā)生凋亡現(xiàn)象。
　　4、為了進(jìn)一步證實(shí)DA是否導(dǎo)致了杏仁核神經(jīng)元的凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用DA（50μM）與DA1受體拮抗劑中文SCH-23390共同孵育神經(jīng)元。實(shí)驗(yàn)分為四組：對照組、DA組、DA+SCH-23390組、SCH-23390組，作用48h后，用Real-time PCR技術(shù)檢測各組促凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)情況；采用TUNEL技術(shù)原位檢測各組TUNEL陽性細(xì)胞率；采用Western blot技術(shù)比較各組ATF-6

8、蛋白的表達(dá)水平情況。
　　5、數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法Tamhane’S T2作兩兩比較，以P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)元原代培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)8-10天后，神經(jīng)元胞體較小，胞核大而圓，突觸細(xì)長、交織成網(wǎng)狀，符合成熟神經(jīng)元的特征。神經(jīng)元胞體的特異性標(biāo)記物MAP-2對神經(jīng)元進(jìn)行

9、免疫熒光染色，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)神經(jīng)元純度≧90％，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、多巴胺對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響
　　①M(fèi)TS篩選杏仁核神經(jīng)元數(shù)量結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杏仁核神經(jīng)元數(shù)量與490nm處吸光度值呈線性相關(guān)，其相關(guān)性達(dá) R2=0.98916。為使 MTS結(jié)果更準(zhǔn)確，將吸光度值選取在0.8-0.9左右，此時(shí)96孔板選取細(xì)胞數(shù)為20000cells/well。
　?、诓煌瑵舛菵A對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響

10、r>　　與對照組相比，50μM、100μM、150μM濃度的DA作用神經(jīng)元48h后，杏仁核神經(jīng)元存活率明顯降低（P<0.05），且呈濃度依賴性；10μM、30μM的DA對神經(jīng)元存活率沒有明顯影響（P>0.05）。因而將50μM作為 DA導(dǎo)致杏仁核神經(jīng)元存活率降低的最低敏感濃度進(jìn)行時(shí)間依賴性檢測。
　　③DA作用不同時(shí)間（24h、48h、72h）對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響
　　與對照組相比，50μM DA作用48h、72后，杏

11、仁核神經(jīng)元存活率明顯降低（ P<0.05）；作用24h時(shí)，杏仁核神經(jīng)元存活率沒有明顯變化（P>0.05）。因此選取50μM的DA作用于杏仁核神經(jīng)元48h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件。
　　3杏仁核神經(jīng)元Bax蛋白轉(zhuǎn)移情況結(jié)果：在DA處理后，通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，觀察到Bax蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的現(xiàn)象，提示DA可能誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。
　　4 RT-PCR檢測杏仁核神經(jīng)元Bax mRNA表達(dá)結(jié)果：與對照組相比， DA組 Bax

12、 mRNA的表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）；而 DA+SCH-23390組相比于DA組，Bax mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），說明DA可以誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡，且多巴胺D1受體參與了凋亡誘導(dǎo)過程。
　　5 TUNEL檢測杏仁核神經(jīng)元凋亡結(jié)果
　　與對照組相比，DA處理后，TUNEL陽性細(xì)胞率明顯增加（P<0.05）。與DA組相比，用DA+SCH-23390共同處理后，TUNEL陽性細(xì)胞率明顯降低（P<0.05

13、），結(jié)合Bax mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果，進(jìn)一步說明DA可以通過D1受體誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡。
　　6 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF-6的表達(dá)結(jié)果
　　與對照組比較，DA組ATF-6蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）；與DA組相比，DA+SCH-23390組ATF-6蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。說明DA誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元的凋亡過程可能有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的參與。
　　結(jié)論：
　　多巴胺可以通過