抗豬肺炎支原體單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬氣喘病的主要病原體。該病分布廣泛，發(fā)病率高，自身致死率不高，但由于Mhp能破壞呼吸道黏膜．纖毛屏障，從而繼發(fā)其它致病菌的感染，提高致死率。由于早期檢測的困難和缺乏有效的藥物，在本病控制方面至今未能達(dá)到滿意的效果。本實驗以Mhp168株為材料，研制出其特異性單克隆抗體，并利用該單克隆抗體建立了間接競爭ELISA方法，檢測豬肺炎支原體抗體，證明有一定的實用性。

2、 實驗用KM<,2>培養(yǎng)基(含豬支原體抗體陰性血清)培養(yǎng)Mhp168株，高速離心收集菌體，用PBS懸浮沉淀。懸浮物反復(fù)凍融再超聲波裂解，用獲得的全菌抗原免疫BALB/c小鼠。取脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA和IHA篩選，有限稀釋法3次克隆，獲得了1株穩(wěn)定分泌抗Mhp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G5。經(jīng)亞類鑒定試劑盒測定，所產(chǎn)生的抗體為IgG型：經(jīng)ELISA方法測定，腹水效價為1：6400；通過Western-

3、blot、間接ELISA和IHA確定，該株單克隆抗體針對Mhp70kD左右的蛋白。 單抗經(jīng)硫酸錢鹽析法純化后，蛋白含量為4.37mg/mL。以Mhp全菌純化蛋白為包被抗原，利用該單克隆抗體與Mhp豬血清競爭該抗原，建立間接競爭ELISA方法檢測Mhp抗體。優(yōu)化的反應(yīng)條件為：Mhp蛋白抗原的最佳包被濃度為15μg/mL(1：800稀釋)：單克隆抗體的工作濃度為10.9μg/mL(1：400稀釋)；競爭反應(yīng)作用時間為37℃lh：酶標(biāo)