實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題解答—abi

1、1.定量PCR儀的開(kāi)關(guān)機(jī)順序是怎樣的？按照正確的開(kāi)關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開(kāi)機(jī)順序：先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。2.哪些種類(lèi)的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實(shí)驗(yàn)使用？有何需要注意的地方？定量PCR實(shí)驗(yàn)可以使用以下耗材：96孔

2、光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號(hào)見(jiàn)下表：3.為什么要定期對(duì)電腦進(jìn)行磁盤(pán)碎片整理？怎樣整理？當(dāng)運(yùn)行實(shí)時(shí)定量PCR儀及使用軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)算機(jī)會(huì)刪除并創(chuàng)建若干文件，計(jì)算機(jī)硬盤(pán)的空閑空間會(huì)被分割成越來(lái)越多的小塊。當(dāng)硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器上文件以分解的碎片存儲(chǔ)時(shí)，程序需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能存取文件，因?yàn)楸仨毝啻螌ふ椅募槠源嫒〔煌?/p>

3、的片斷。碎片整理實(shí)用程序?qū)⒁粋€(gè)文件分解開(kāi)的多個(gè)碎片合并在一起，并存儲(chǔ)到硬盤(pán)的同一個(gè)位置，從而清除文件碎片，進(jìn)而優(yōu)化系統(tǒng)性能。濕度：2080%；對(duì)于潮濕的省份，推薦實(shí)驗(yàn)室配備除濕機(jī)?？臻g：易于操作，安全。7.怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個(gè)孔

4、的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完8.什么是背景校正？多長(zhǎng)時(shí)間執(zhí)行一次背景校正？背景校正程序測(cè)量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號(hào)收集的溫度為60C。隨后，SDS軟件計(jì)算

5、所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動(dòng)調(diào)用此校正文件，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中扣除背景信號(hào)。因?yàn)楸尘盁晒獾男盘?hào)強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來(lái)的污染、反應(yīng)板反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般每三個(gè)月到半年校正一次。9.什么是純熒光校正？多長(zhǎng)時(shí)間校正一次？純熒光校正是測(cè)定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，通俗地說(shuō)是讓儀器“認(rèn)識(shí)”各種熒光染料。軟件收集并儲(chǔ)存各種純熒光染料

6、標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后每次定量實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號(hào)，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，精確扣除不同染料的信號(hào)重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類(lèi)和信號(hào)強(qiáng)度。推薦每隔半年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前，請(qǐng)先進(jìn)行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎樣封膜？當(dāng)使用96孔板做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來(lái)密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按壓