細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1、1實(shí)驗(yàn)一、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材和試劑的準(zhǔn)備1、哪些物品適合于高壓滅菌，并說(shuō)明理由。①材料：微孔濾膜(直徑25cm)：孔徑為0.22μm、微孔濾膜(直徑90cm)：孔徑為0.22μm、過(guò)濾器(直徑25cm)。②儀器和器材：眼科剪刀和鑷子、長(zhǎng)鑷子、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試劑瓶（或鹽水瓶）、移液槍、10毫升試管、10毫升離心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不銹鋼過(guò)濾器、塑料過(guò)濾器、注射器、超凈工作臺(tái)、干燥箱、高壓滅菌鍋、正壓泵。理由：適合于高

2、壓滅菌是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些耐高溫的塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液(如Hanks液、PBS等)。2、細(xì)胞培養(yǎng)常用液體如何配制和滅菌？1）PBS：8.0gNaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000mL雙蒸水，高壓滅菌，4℃保存。（準(zhǔn)備試劑瓶）滅菌方法：高壓滅菌。2）干粉培養(yǎng)基過(guò)濾除菌（先準(zhǔn)備好不銹鋼過(guò)濾器及濾膜，安裝后高壓滅菌，適度烘干；鋁盒4個(gè)，三角瓶2個(gè)，

3、容量瓶，不銹鋼過(guò)濾器一套，酒精燈，酒精棉球3瓶，吸耳球3個(gè)，吸量管10毫升和5毫升各5根，分裝用瓶，血清，超純水，抗生素）認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。配制方法（1L）：1）在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入大約500mL雙蒸水。2）在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基。3）水洗袋內(nèi)殘

4、留培養(yǎng)基，全部轉(zhuǎn)移到容器內(nèi)，輕輕攪拌，不要加熱。4）完全溶解之后，1袋1L粉狀DMEM加3.7gNaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸鈉，即0.11gL，添加雙抗。5）用雙蒸水定容到1L，攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?）通過(guò)緩慢攪拌加入1NNaOH或1NHCL調(diào)節(jié)pH值培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保持密封。7）立刻不銹鋼過(guò)濾器過(guò)濾除菌，貼上標(biāo)簽，4℃保存?zhèn)溆?。滅菌方法：高壓滅菌?）胰蛋白酶EDTA消化液①胰蛋白酶溶液配制：稱取胰蛋白酶（1:250）粉

5、末0.25g置燒杯中，溶于100mLPBS，攪拌混勻，置室溫4小時(shí)并不斷攪拌振蕩，過(guò)濾除菌。（若配制400mL則應(yīng)稱取1g胰蛋白酶）滅菌方法：過(guò)濾除菌。②EDTA溶液配制：0.2gEDTA用400mLPBS溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存。滅菌方法：高壓蒸汽滅菌。胰蛋白酶與EDTA按1：1混合后分裝，4℃冰箱保存。3配的包裝一次使用。(3)溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90%－95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再定容。(4)如需

6、添加的組分較多時(shí)，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。(5)待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉。(6)所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過(guò)濾或高壓除菌。(7)在過(guò)濾前，可將pH調(diào)至比所需值低0.10.2個(gè)單位。(8)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。(9)建議用1NHCl或1NNaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。8、物品放進(jìn)飯盒后要貼好標(biāo)簽，還需要用棉布或牛皮紙包好再貼上標(biāo)簽。在標(biāo)簽處包扎

7、好。容器，包括裝PBS的玻璃瓶，瓶口要擰松，不能緊，瓶口包扎牛皮紙，滅菌后立刻擰緊瓶蓋，然后再取出，冷卻后放入冰箱。注意檢測(cè)標(biāo)簽是否脫落。9、根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)的要求，準(zhǔn)備好所需物品，一并放入超凈臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備的數(shù)量要大于實(shí)際使用數(shù)，瓶蓋要大于瓶數(shù)。要配備至少三套器械（一套使用，一套備用，一套清洗滅菌），循環(huán)使用。10、玻璃瓶、移液管要封閉包扎使用端，標(biāo)記手持端。實(shí)驗(yàn)二雞胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、如何進(jìn)行雞胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)

8、進(jìn)行前，準(zhǔn)備好相關(guān)器材，無(wú)菌室及超凈工作臺(tái)以紫外燈照射滅菌3060分鐘（溶液同時(shí)37℃預(yù)熱），然后開(kāi)啟通風(fēng)10分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)用品以75%酒精擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在中央無(wú)菌區(qū)域酒精燈火焰旁進(jìn)行。1、取910日齡的雞胚，用酒精消毒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，小心取出雞胚，放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，除去頭尾、四肢及內(nèi)臟；2、胚體用含雙抗PBS沖洗23次，切成12mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)入容積適量大小的離心管；3、按每個(gè)雞胚加入大約5m

9、L的胰酶消化液，在室溫（或37℃）下消化10min，吸管（或槍頭）不停吹打；4、加入含小牛血清培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液，沒(méi)有消化完全的組織塊可再消化一次；5、收集到的細(xì)胞懸液經(jīng)100目過(guò)濾篩過(guò)濾，1200轉(zhuǎn)離心5min；離心管用酒精擦拭后拿進(jìn)超凈臺(tái)，擰開(kāi)蓋子后，管口過(guò)火焰兩次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下過(guò)火焰兩次；6、細(xì)胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮；7、以5105個(gè)mL的密度溶液3.