質(zhì)粒dna的提取、純化和電泳檢測

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取、純化和電泳檢測的提取、純化和電泳檢測姓名學(xué)號同組人班級實(shí)驗(yàn)時(shí)間摘要：摘要：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA，它是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。堿變性提取法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。電泳是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

2、本次實(shí)驗(yàn)利用堿變法對E.coliDH5受體菌中質(zhì)粒pUC19的DNA進(jìn)行提取、純化和電泳檢測，旨在學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA提取的原理、?純化及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。通過此次實(shí)驗(yàn)，我們達(dá)到了預(yù)期效果。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA、堿變性提取法、質(zhì)粒DNA的純化、DNA凝膠電泳1.1.引言引言質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。細(xì)菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。一些質(zhì)粒永遠(yuǎn)獨(dú)立于染色體之外，另

3、外一些質(zhì)粒在一定條件下會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子（簡稱cccDNA）。由于質(zhì)粒分子小、便于分離和提取的特點(diǎn)，在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過改造后的質(zhì)?？赏ㄟ^連接外源基因構(gòu)成重組體，攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)菌、動物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)，因此質(zhì)粒是基因工程中一種非常重要的載

4、體。質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細(xì)菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性分析。近年來由于基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)?；蛱结樀拈_發(fā)和應(yīng)用也得到了飛速的發(fā)展，所以這就要求我們從宿主細(xì)胞中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。因此，質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)最基本的工作。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿裂解堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，是一種應(yīng)用最為廣

5、泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的，適用于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA

6、均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。當(dāng)用pH值4.8的KAc（或NaAc）高鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮

7、狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0.5％時(shí)凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。2.2.材料和方法材料和方法2.12.1材料和試劑材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：E.coliDH5受體菌（生長在LB固體培養(yǎng)基）、有Amp標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19?r實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基、

8、氨芐青霉素（Amp）母液（儲存濃度100mgmL）、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、TE緩沖液、Tris飽和酚、氯仿異戊醇混合液、酚氯仿異戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3MNaAc溶液、冰乙醇、70%乙醇、RNaseA、滅菌雙蒸水ddH2O、50TAE緩沖液、10mgmL溴化乙錠（EB）溶液、6上樣緩沖液（6loadingbuffer）、瓊脂糖、SupercoiledDNALadderMarker、pUC19、pUC19HindⅢ實(shí)驗(yàn)

9、儀器：接種環(huán)、三角瓶、天平、紅蓋瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、100mL離心管、1.5mL塑料離心管、4℃離心機(jī)、渦旋振蕩器、微量移液器、不同型號槍頭、制膠板、制膠槽、樣品梳、電泳儀、紫外燈、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、記號筆、盛冰的搪瓷杯、離心管架、手套2.22.2方法方法2.2.1E.coliDH5（pUC19）菌體培養(yǎng)?（1）用Amp母液和LB液體培養(yǎng)基配制LBAmp（Amp工作濃度為100μgmL）液體培養(yǎng)基。（2）用酒精燈灼燒且

10、冷卻后的接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基上挑取E.coliDH5單菌落，將?接種環(huán)伸至LBAmp液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基與三角瓶瓶壁交界面處向液體培養(yǎng)基中接種E.coliDH5（pUC19）。?（3）將培養(yǎng)基在37℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)過夜。（4）從過夜培養(yǎng)基中取1%接種量接種到新的LBAmp（Amp工作濃度為100μgmL）培養(yǎng)基，將新的培養(yǎng)基在37℃、200rpm下振蕩4～6小時(shí)，最后得到菌液。2.2.2堿裂解變性法提取質(zhì)粒DNA（1）

11、取出一支滅菌的100mL離心管，標(biāo)記上組號，用天平稱量其重量，并記錄為W1。（2）向100mL離心管中倒入菌液至距瓶口13處，每兩組的兩支100mL離心管配平。（3）將菌液在4℃離心機(jī)中6000rpm離心5min，棄上清。（4）向菌液中加入5mL溶液Ⅰ，渦旋振蕩，將菌液在4℃離心機(jī)中6000rpm離心5min，棄上清。（5）將100mL離心管稱重，標(biāo)記其質(zhì)量為W2，計(jì)算W2W1。（6）每100mg菌體量，加入（按菌體量接近的重新分組，溶

12、液Ⅰ補(bǔ)平）：①1.0mL溶液Ⅰ，充分渦旋振蕩，用溶液Ⅰ再次配平；②2.0mL溶液Ⅱ，輕柔顛倒混勻，冰浴3～5min；③1.5mL溶液Ⅲ，輕柔顛倒混勻，冰浴5min。（7）將菌液在4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管內(nèi)，記錄體積V。（8）加入2V冰乙醇，顛倒混勻；20℃靜置15min。（9）將菌液在4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min，棄上清。（10）加入5mL70%乙醇，12000rpm離心3min