電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒dna

1、質(zhì)粒的構(gòu)建：1.酶切反應(yīng)按照1ugDNA需110u內(nèi)切酶的用量，在反應(yīng)體系中加入相應(yīng)的10緩沖液，內(nèi)切酶的體積不得大于總體積的十分之一，ddH2O補(bǔ)足體系，如需長時(shí)間消化，還需加入適量的BSA已穩(wěn)定內(nèi)切酶活性。2.DNA片斷的回收欲回收的DNA片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下所需片斷所在的凝膠（膠的體積盡可能小），加入3倍體積的BufferQX1及適量的QIAXⅡ(Glassmilk)55℃10分鐘，每隔2分鐘渦旋1次，待凝膠完全溶解，

2、12000轉(zhuǎn)離心1分鐘，BufferQX1洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠.。再用BufferB洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適當(dāng)體積的ddH2O離心后收集上清，瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。3.DNA片斷3凹端的補(bǔ)平于Eppendf管中依次加入DNA0.25ug2mMdNTP2ul人以一種酶切緩沖液（10）2ul加水至19ul。然后加入15單位Klenow酶，混勻后室溫下反應(yīng)15分鐘。待補(bǔ)平反應(yīng)結(jié)束后，于65℃水浴20分鐘使Klenow酶失活

3、，電泳定量后即可用于連接反應(yīng)或20℃保存?zhèn)溆谩?.DNA片斷3凸端的補(bǔ)平于Eppendf管中依次加入DNA0.25ug2mMdNTP2ul人以一種酶切緩沖液（10）2ul。加水至19ul。然后加入12單位T4噬菌體DNA聚合酶，12℃溫育15分鐘，于75℃加熱10分鐘，使T4噬菌體DNA聚合酶滅活。5.載體的脫磷酸化：載體質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶酶切后可直接進(jìn)行脫磷酸化處理。40ul的酶切反應(yīng)體系，景點(diǎn)永建車酶切完全后可加入10CIAP（牛小腸堿性

4、磷酸酶）緩沖液5ul水4ul和適量CIAP進(jìn)行脫磷酸化反應(yīng)。CIAP的用量依載體5端磷酸的摩爾數(shù)及末端性質(zhì)而定，對(duì)于5突出的末端，每100pmol5末端磷酸需1單位CIAP，對(duì)于5凹端或平末端，每2pmol5端末端磷酸需1單位CIAP一般2ug5kb的線性化質(zhì)粒DNA約翰1.4pmol5端磷酸。反應(yīng)條件：1）5突出末端：加入CIAP后于37℃反應(yīng)30分鐘，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。2）5凹或平末端：

5、加入CIAP后于37℃反應(yīng)15分鐘，56℃反應(yīng)15分鐘，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，又于37℃反應(yīng)15分鐘，56℃反應(yīng)15分鐘。取0.1ml過夜菌液接種到含抗菌素的25mlLB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)到OD600接近0.6，將25ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含抗菌素的500mlLB培養(yǎng)基中，37℃振搖2.5小時(shí)（OD600約為0.4），加入2.5ml氯霉素溶液（34mgml）37℃振搖培養(yǎng)過夜，于4℃4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集菌

6、體，用20ml含溶菌酶（5mgml）的溶液Ⅰ（25mMTrisClpH8.010mMEDTApH8.050mMSucrose）懸浮細(xì)菌，室溫靜置5分鐘，加入新鮮配置的溶液Ⅱ（0.2MNaOH1%SDS）40ml，冰上混勻變性10分鐘，加入30ml溶液Ⅲ（3MKACpH4.6）中和10分鐘。4℃12000轉(zhuǎn)離心20分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置30分鐘，室溫12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，用70%乙醇洗沉淀一

7、次，室溫晾干，沉淀溶于8mlTE緩沖液中稱取8gCSCl加至DNA溶液中，加入0.6mlEB（10mgml）溶液中于20℃，45000轉(zhuǎn)離心24小時(shí)，用毛細(xì)管吸出質(zhì)粒DNA區(qū)帶。水飽和正丁醇抽提數(shù)次去除EB，用4倍體積ddH2O稀釋含CSCl的DNA溶液，再用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA20℃靜置12小時(shí)，于4℃15000轉(zhuǎn)離心20分鐘，用70%乙醇沉淀一次，室溫晾干后，榮譽(yù)適量的（0.51ml）TE緩沖液中，電泳檢查DNA質(zhì)量，讀

8、取OD260與OD280，計(jì)算DNA濃度與純度。電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA1)電穿孔前一天，以合適密度傳代細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前處于對(duì)數(shù)生長期。2)胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。用電轉(zhuǎn)緩沖液洗細(xì)胞兩次。電轉(zhuǎn)緩沖液為磷酸緩沖液。3)棄上清，用0.5ml電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度最好在21062107之間。細(xì)胞懸液移入0.4cm電轉(zhuǎn)杯中，加入540ug質(zhì)粒，輕彈混勻。置于冰上10分鐘。4)電擊。對(duì)大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞，電壓為250400伏，即

9、6251000vcm，電容為960uF。在此條件下，電擊時(shí)間大約在3050毫伏。不同的細(xì)胞電轉(zhuǎn)的最適條件不同，細(xì)胞電擊后死亡率在40%60%左右時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。5)電擊結(jié)束后，將細(xì)胞置于冰上10分鐘。有文獻(xiàn)報(bào)道，電擊前后置于冰上10分鐘可提高轉(zhuǎn)染效率。6)電擊后，細(xì)胞移入非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)數(shù)，稀釋15倍以上，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。24天換液，直至抗性克隆形成。如用于篩選單克隆，HeLa細(xì)胞電擊24小時(shí)后計(jì)數(shù)，細(xì)胞用選擇培